PhD Thesis_ver3.pdf

133
III. Материали и методи – Методи
4. Надстоящата течност се изхвърля. Утайките от клетки се ресуспендират в по 2 ml
физиологичен разтвор.
5. Епруветките се центрофугират 5 минути при 300 × g (1 500 об./мин с ротор
220.97).
6. Надстоящата течност се изхвърля. Утайките от клетки се ресуспендират в по 5 ml
прясна хранителна среда и се прехвърлят в нови петрита.
7. Към третата група проби се прибавя разтвор на куркумин до крайна концентрация
20 µM.
8. Към всички петрита се прибавя разтвор на As2O3 до крайна концентрация 5 µM.
9. Петритата се връщат в инкубатора.
10. През определени периоди от време (напр. 15, 30, 45, 60, 90 и 120 минути след
прибавянето на As2O3) се взимат проби от трите групи. Пробите се прехвърлят в цент-
рофужни епруветки.
11. Епруветките се центрофугират 5 минути при 300 × g (1 500 об./мин с ротор
220.97).
12. Надстоящата течност се изхвърля. Утайките от клетки се ресуспендират в по 1 ml
фосфатен буфер, към който е добавена EDTA до крайна концентрация 1 mM, след кое-
то се прехвърлят в 1,5-милилитрови епруветки.
13. Епруветките се центрофугират 5 минути при 600 × g (3 000 об./мин с ротор F-45-
12-11).
14. Надстоящата течност се изхвърля. Утайките от клетки се ресуспендират в по 1 ml
фосфатен буфер.
15. Епруветките се центрофугират 5 минути при 600 × g (3 000 об./мин с ротор F-45-
12-11).
16. Надстоящата течност се изхвърля. Утайките от клетки се съхраняват при −80°C
до момента на анализ чрез ААС.
17. Всяка проба се претегля заедно с епруветката, след което се лизира с 1 ml 25%-ен
воден разтвор на тетраметиламониев хидроксид. Епруветките се претеглят отново и
разликите в теглото се записват.
18. Така приготвените проби се предават на проф. Соня Ганева (Химически факултет
на Софийски университет „Св. Климент Охридски”) за анализ чрез ААС.
19. От получените резултати в милиардни части арсен на единица тегло от пробата, и
като се знае теглото на отделните проби, се изчислява цялото количество арсен във вся-
ка проба. Като се знае броят на клетките във всяка проба, се намира и количеството