Hereditäre Tumorsyndrome des Kolons und Rektums

3.2.1. Isoelektrische Fokussierung ( IEF ) mit IPG-Strips ( 1. Dimension )
Die Einführung von immobilisierten pH-Gradienten in Gelstreifen (IPG-Strips) war
eine wichtige Voraussetzung für die Reproduzierbarkeit und damit den Durchbruch
der 2-DE basierten Proteomforschung 121-123 . Die IPG-Strips werden heute in
verschiedenen Längen und für unterschiedliche pH Bereiche kommerziell
angeboten. In der vorliegenden Studie wurden industriell hergestellte IPG-Strips
(pH 4-7, 17cm Länge) der Firma Bio-Rad ® benutzt, da sie eine Separation von
1500-2000 Proteinen ermöglichen.
Da das Trennprinzip der 1. Dimension Ladungsunterschiede ausnutzt, müssen die
Proteine zunächst löslich gemacht werden. Die komplette und gleichbleibende
Löslichkeit der Proteine („Solubilisierung“) während des gesamten Vorgangs der
zweidimensionalen Gelelektrophorese ist die Grundvoraussetzung zur Separation
124 . Hierzu wird zunächst ein Rehydrierungspuffer, bestehend aus 7M Urea, 2M
Thiourea, 1% 3-(3-Chloramidopropyl) Dimethylammonio-1-propanesulfonate
(CHAPS), 0,4% immobilized pH gradient IPG Puffer, 0,3% Dithiothreitol (DTT) und
etwas Bromophenol Blau in jeden der gesäuberten Schächte des IPGphor
Isoelectric Focusing Systems (PROTEAN IEF ® , BioRad ® ) hinzugegeben. Die
IPG-Strips werden mit der Gelseite nach unten im jeweiligen Schacht plaziert. Es
ist darauf zu achten, dass das Gel vollständig vom Puffer umflossen wird. Die IPG-
Strips werden mit Öl bedeckt und der „stripholder“ wird verschlossen. Die IPG-
Streifen werden bei Raumtemperatur für 10 Stunden rehydriert.
Fertige industriell
hergestellte Gelstreifen
pI – Isoelektrischer Punkt
Abb.11: Schematische Darstellung der 1. Dimension; industriell hergestellte IPG-
Strips (Fa. BioRad)
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