Hereditäre Tumorsyndrome des Kolons und Rektums

Minuten alkyliert. Trypsin wurde hinzugegeben und die Lösung wurde für 4,5 h bei
40° C inkubiert. Die Peptide wurden nacheinander mit 30µl 5% Formic Acid / 2%
Acetonitrit und 24µl 2,5% Formic Acid / 50% Acetonitrit extrahiert. Das Acetonitrit
verdunstete über Nacht. Zur „electrospray (ES) ionization“ MS/MS wurden die
extrahierten Peptide mit C18 ZipTips (Millipore) entsalzt und jeweils zweimal mit
10µl 70% Acetonitrit / 0,1% Trifluoressigsäure (TFA), 10µl 50% Acetonitrit / 0,1%
TFA und 10µl 0,1% TFA equilibriert. Die Proben wurden durch Pipettieren auf den
ZipTip aufgetragen. Es folgte ein weiteres zweimaliges Waschen mit 10µl 0,1%
TFA. Die Reste des Trypsins wurden mit 60% Acetonitrit / 1% Essigsäure
ausgewaschen.
Die Proteinproben, die nur in kleinen Mengen vorlagen, wurden mit der Gyrolab
MALDI SP1 Workstation (Gyros AB, Uppsala Sweden) analysiert (Abb.17).
In Mikrokolumnen aufgetragenen
fragmentierte
Polypeptide
Reinigen und Entsalzen
der Proben in der CD-
Platteform
MALDI MS
Analyse
Abb.17: Gyrolab MALDI SP1 Workstation (Gyros AB, Uppsala Sweden)
Eine „96 microcolumnes plate“ wurde auf eine CD-Plattform aufgebracht und es
erfolgte das Entsalzen mittels „reverse phase“ Chromatographie. In den
Mikrokolumnen war 50%iges Acetonitrit in Wasser gelöst. Die Proben wurden auf
die Mikrokolumnen aufgetragen, und die Lösung wurde durch Zentrifugieren
weiterbefördert. Die „washing solution“ (200nl 0,1% TFA) wurde entfernt. Die
Peptide wurde mittels einer Lösung aus 1mg/ml alpha-cyano-4-hydroxycinamid
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