TESI Dottorato FAVILLA MARA - Università degli Studi del Molise

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2.2 Materiali e Metodi 2.2.1 Campioni di semola Sono stati esaminati 30 campioni di semola rimacinata di grano duro (Tabella 2.1). Le semole derivano da 6 varietà di grano duro (Appulo, Simeto, Duilio, Arcangelo, Ciccio e Svevo) coltivate in provincia di Bari (zone di Minervino, Spinazzola e Gravina) e provenienti dallo stesso molino. I grani di ciascuna varietà, prima di essere macinati, sono stati sottoposti a due tipi di condizionamento: breve (7 - 8 ore) e lungo (15 -16 ore). Inoltre sono state preparate 12 miscele (rapporto 1:1). Dalle cariossidi delle varietà Svevo, Ciccio e Appulo sono stati ottenuti campioni di semola integrale, anch’essi sottoposti ai due diversi tipi di condizionamento. 2.2.2 Analisi microbiologiche Venti grammi di ciascun campione di semola sono stati diluiti in 180 ml di una soluzione sterile di Bacto-peptone (Difco Lboratory Inc, Detroit, MI, USA) 0,1% (p/vol) e omogeneizzati per 2 min mediante Stomacher Lab-Blender 400 (PBI International Milano,Italia). Da questa sospensione sono state preparate diluizioni seriali decimali in NaCl 0,85% (p/vol) - Tween 80 0,25% (vol/vol). Sono stati impiegati i seguenti substrati di crescita: Plate Count agar (PCA, Oxoid Ltd, Basingstoke, UK) per valutare la carica batterica mesofila totale, e Sourdough Bacteria (SDB) agar (Kline et al., 1971) per la conta di batteri lattici presunti. Allo scopo di isolare un sufficiente numero di colonie, sono stati inoculati in piastra 1 ml della diluizione 10 0 (per inclusione) e 100 µl delle diluizioni 10 -1 e 10 -2 (per piastramento). Le piastre sono state incubate in un termostato a 30°C per 48 h. Da ciascun campione di semola esaminato, sono state prelevate in modo casuale 10- 20% delle colonie totali (LAB presunti) da piastre contabili di SDB. Batteri Gram- positivi, catalasi negativi (LAB) sono stati coltivati in SDB agar a 30°C per 48 h e strisciati nuovamente su SDB agar. Tutti gli isolati considerati per le successive analisi sono stati conservati a –80°C in SDB brodo contenente glicerolo al 20% (vol/vol). 2.2.3 Amplificazione mediante rep-PCR Il DNA genomico è stato estratto da 1,5 ml di coltura inoculata in MRS (Oxoid) ed incubata per 18 h a 30°C. L’estrazione è stata eseg uita utilizzando il kit della Whatman (Clonsaver Card Starter Kit) e seguendo il protocollo allegato. Il DNA 38
genomico è stato amplificato utilizzando due oligonucleotidi REP-1R-Dt (5'- IIINCGNCGNCATNGGC-3) e REP-2R-Dt (5'- NCGNCTTATCNGGCCTAC-3') in cui la lettera N può indicare le basi A, T, C o G, mentre I corrisponde alla base inosina (Hyytia-Trees et al., 1999; Versalovic et al., 1991). Le reazioni di amplificazione sono state condotte in un volume di 25 µl contenenti 23 µl di MegaMix (Microzone Ltd., United Kingdom), 2 µM di ciascun oligonucleotide e 1µl di DNA genomico. Le amplificazioni sono state eseguite in un termociclatore GeneAmp PCR system 9700 (Perkin Elmer-Applied Biosystems) programmato come segue: 95°C per 7 min, 35 cicli di 30 sec a 90°C, 1 min a 40°C, 8 min a 65 °C seguiti da 16 min a 65°C. I prodotti di amplificazione sono stati visualizzati mediante elettroforesi a 80V per 3 h su gel al 1,5 % (p/vol) di agarosio in tampone TAE 1 x colorato con etidio bromuro (0,5 µg/ml). Come indicatore delle dimensioni dei frammenti di DNA è stato impiegato il GelPilot 200 bp ladder (Qiagen GmbH, Hilden, Germany). I profili elettroforetici sono stati analizzati utilizzando il software Quantity One (Bio-Rad Laboratories). La riproducibilità dei profili è stata verificata ripetendo le analisi due volte. In ciascun isolato è stata valutata la presenza/assenza (1/0) di tutte le bande ottenute nell’intera popolazione batterica analizzata. La matrice binaria ottenuta è stata analizzata con il software BioNumerics v. 5.0 (Applied Maths), usando il coefficiente di similarità genetica di Dice (SD) e l’algoritmo UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean) per l’ottenimento del dendrogramma. 2.2.4 Identificazione genetica mediante sequenziamento del gene 16S - rRNA Gli isolati rappresentativi di ciascun profilo rep-PCR sono stati identificati mediante analisi delle sequenze del 16S rRNA. Il DNA genomico, estratto come descritto precedentemente è stato amplificato con gli oligonucleotidi universali P0 e P6 (Tabella 2.2) (Di Cello et al., 1997). In un volume finale di 50 µl, sono stati aggiunti: 5 µl del tampone 10 x HotMaster TM Taq Buffer con Mg 2+ (2,5 mM), 0,2 mM dNTP Mix, 1,25 U HotMaster TM Taq DNA Polymerase (Eppendorf AG, Hamburg, Germany), 0,3 µM di ciascun oligonucleotide e 1 µl di DNA totale. La reazione di amplificazione è avvenuta secondo il seguente protocollo “touch-down” (Di Cello et al. 1997): 94°C per 2 min, 35 cicli di 30 sec a 94°C, 30 sec a 60°C per i primi 5 cicli, 55°C per i successivi 5 cicli e 50 °C per gli ultim i 25 cicli, 4 min a 68 °C seguiti da 10 39
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Makanjuola D. B., Tymon A., Springh
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Sinopsi Obiettivo: sviluppare metod
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