TESI Dottorato FAVILLA MARA - Università degli Studi del Molise

polimerasi, 5µl di mix 10X del kit AccuPrimeTM Pfx DNA polimerasi (Invitrogen, Life
Technologies CA, USA), 0,3 µM di ciascun innesco e 1 µl di DNA.
Gli oligonucleotidi P0 e P16S-1541 usati per l’amplificazione del 16S rDNA sono
localizzati alle estremità 5’ e 3’ del gene 16S Tabella 3.2).
L’amplificazione PCR è stata eseguita in un termociclatore GeneAmp PCR
rRNA e la loro posizione rende possibile l’amplificazione di quasi tutto il gene
(system 9700 (Perkin Elmer-Applied Biosystems) programmato come segue: una
prima incubazione a 95°C per 5 minuti, 30 cicli com posti da 40 secondi a 95°C, 60
secondi a 53°C e 2 minuti a 72°C, seguiti da una es tensione finale a 72°C per 10
minuti (Zheng et al., 2008).
Un’aliquota (2µl) dei prodotti di amplificazione è stata analizzata mediante
elettroforesi su gel di agarosio all’1% (p/vol) (Shelton Scientific) colorato con etidio
bromuro (0,5 μg/ml). Il peso molecolare dei frammenti di DNA amplificati è stato
stimato mediante comparazione con DNA di peso molecolare noto compreso tra
100 e 12000 bp (Gel Pilot 100 bp plus ladder Qiagen GmbH, Hilden, Germany). La
purificazione del frammento di DNA amplificato, dai componenti della reazione PCR,
è avvenuta utilizzando il kit QIAquick PCR Purification (Qiagen). La quantità e la
qualità del DNA purificato sono state valutate mediante spettrofotometro ND 1000
(NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, USA).
Il sequenziamento dei prodotti di PCR del 16S rDNA è stato effettuato
utilizzando il “BigDye TM Terminator cycle sequencing kit” (Applied Biosystems) e gli
inneschi P0, P6, P6 We16S2r ed il P5 (Tabella 3.2). Le reazioni di sequenza sono
state condotte in un volume di 5µl contenenti circa 15 ng di DNA purificato, l’innesco
alla concentrazione 0,16 µM, 1µl del tampone e 1µl di mix del suddetto kit.La
reazione di sequenza è stata eseguita in un termociclatore GeneAmp PCR system
9700 (Perkin Elmer-Applied Biosystems) programmato come segue: 25 cicli di 10
secondi a 96°C, 5 secondi a 50°C, 4 minuti a 60°C. I prodotti di reazione sono stati
purificati utilizzando colonnine di Sephadex (5% p/vol, Sigma) ed analizzati con un
sequenziatore automatico ABI Prism 3100 (Applied Biosystems). Le sequenze
parziali sono state assemblate e comparate usando il software BioNumerics v. 5.1
(Applied Maths, Inc., Austin, Texas, USA). Le sequenze del 16S rDNA così ottenute
sono state confrontate con le sequenze depositate in banca dati utilizzando il
programma Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) disponibile attraverso il
National Centre for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
allo scopo di identificare quelle che presentavano il livello di identità più elevato. I
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