TESI Dottorato FAVILLA MARA - Università degli Studi del Molise

IIINCGNCGNCATCNGGC-3’; 5’-NCGNCTTATCNGGCCTAC-3’; N = A, T, C o G; I =
iosina) (Hyytia-Trees et al. 1999), e REP1R-I/REP2-I (5’-IIIICGICGICATCIGGC-3’;
5’-IIICGNCGNCATCNGGC -3’, e due inneschi (GTG)5 (5’-GTGGTGGTGGTGGTG-
3’) e BOX A1R (5’-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3’) (Coudeyras et al., 2008).
Gli inneschi sono stati utilizzati singolarmente in tre serie di amplificazioni.
Le reazioni di amplificazione sono state condotte in un volume finale di 25 µl
contenenti 23 µl di MegaMix (Microzone Ltd., United Kingdom), 2 µM di ciascun
oligonuocletide e 10 ng di DNA genomico. Le amplificazioni sono state eseguite in
un termociclatore GeneAmp PCR system 9700 (Perkin Elmer-Applied Biosystems)
programmato come segue: una iniziale denaturazione a 94°C per 5 minuti, seguita
da 35 cicli comprendenti una denaturazione di 30 secondi a 94°C, una fase di
appaiamento di 1 minuto e una fase di allungamento di 4 minuti a 72°C, seguiti da
un’estensione finale a 72°C per 7 minuti. La fase d i appaiamento è stata condotta a
40°C per le coppie di inneschi REP-1R-Dt/REP-2R-Dt e REP 1R-I/REP 2-I, a 50° C
per l’innesco BOX A1R e 45°C per l’innesco (GTG) 5.
I prodotti di amplificazione sono stati analizzati mediante elettroforesi con un
Bioanalizzatore Agilent 2100 (Agilent Technologies GmbH, Waldbronn, Germany)
avvalendosi del kit DNA1000 della stessa ditta. Un microlitro di ciascun prodotto di
PCR è stato posto nel pozzetto del chip per la separazione del DNA seguendo il
protocollo della ditta. I dati sono stati visualizzati come elettroferogrammi o come
immagini gel-simili. Il peso molecolare dei frammenti di DNA amplificati, è stato
stimato mediante comparazione con DNA di peso molecolare noto compreso tra 50
e 10380 bp. Nelle condizioni sperimentali utilizzate l’innesco (GTG)5 ha permesso
una migliore discriminazione dei diversi profili per cui è stato scelto per lo studio di
caratterizzazione degli isolati.
La riproducibilità delle bande ottenute attraverso rep-PCR (Ripetitive
Extragenic Palindromic), è stata valutata comparando i prodotti PCR ottenuti da 3
colture separate dello stesso ceppo.
3.2.3 Identificazione molecolare di Bacillus spp
Un isolato rappresentativo di ciascun profilo rep-PCR è stato identificato mediante
analisi delle sequenze del gene dell’rRNA 16S. Per l’amplificazione è stata usata la
coppia di inneschi P0/P16S-1541 (Di Cello et al. 1997, Oomes et al. 2007).
Cinquanta microlitri di ogni miscela PCR contenevano 0,025U/µl di Taq DNA
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