TESI Dottorato FAVILLA MARA - Università degli Studi del Molise

DNA è concentrato e purificato utilizzando isopropanolo. In breve: le cellule sono
state ottenute centrifugando 1,5 ml di coltura batterica a 13000 x g per 2 minuti. Il
precipitato dopo essere stato lavato con soluzione fisiologica (cloruro di sodio allo
0,85% p/vol) è stato risospeso in 480 µl di EDTA (50 mM pH 8) e trattato
enzimaticamente con lisozima (10 mg/ml, Sigma) per 60 minuti a 37°C, al fine di
lisare la parete cellulare e favorire l’estrazione del DNA. Al termine dell’incubazione
il preparato così ottenuto è stato centrifugato; il precipitato è stato risospeso in 600
µl di Nuclei Lysis solution, incubato a 80°C per 5 m inuti e lasciato raffreddare a
temperatura ambiente. Successivamente il lisato cellulare è stato trattato con una
soluzione contenente l’enzima Rnase per 30 minuti a 37°C in modo da permettere
all’enzima di agire degradando l’RNA presente. Dopo aver lasciato raffreddare il
lisato cellulare a temperatura ambiente, sono stati aggiunti 200 µl di una soluzione
(Protein Purification solution) che permette la precipitazione delle proteine presenti
in soluzione agevolata anche dall’incubazione in ghiaccio per 5 minuti. Al termine
dell’incubazione il DNA è stato separato dal materiale cellulare per centrifugazione,
la fase liquida contenete il DNA in soluzione è stata trasferita in 600 µl di
isopropanolo e il DNA precipitato mediante centrifugazione (13000xg per 5 min.).
L’isopropanolo è stato rimosso e il DNA lavato con etanolo al 70% vol/vol. L’etanolo
è stato successivamente allontanato mediante centrifugazione. Il DNA ottenuto è
stato reidratato in 50 µl di acqua ultrapura ((Millipore Corporation, Bedford, MA,
USA) riscaldandolo a 56°C per 15 minuti. Successiva mente il DNA estratto è stato
quantificato mediante lettura spettrofotometrica (ND 1000, NanoDrop Technologies)
e impiegato per l’analisi rep-PCR al fine di caratterizzare le diverse specie e i diversi
ceppi.
3.2.3 Amplificazione mediante rep-PCR Caratterizzazione genotipica
mediante rep-PCR
La diversità genetica esistente tra gli isolati batterici ottenuti, è stata indagata
mediante la tecnica molecolare rep-PCR. Al fine di discriminare i diversi ceppi
presenti, il DNA genomico estratto è stato amplificato utilizzando tre diverse
condizioni di amplificazione, in modo da permettere l’individuazione delle condizioni
di amplificazione migliori in grado di fornire il maggior numero di profili con il più alto
numero di bande discriminanti. In una fase preliminare sono stati valutati diversi
oligonucletidi per amplificare il DNA di 11 isolati. Per amplificare il DNA genomico
sono state scelte le due coppie di inneshi REP-1R-Dt/REP-2R-Dt (5’-
70