TESI Dottorato FAVILLA MARA - Università degli Studi del Molise

3.3 Risultati
3.3.1 Isolamento e caratterizzazione di Bacillus spp.
L’analisi microbiologica dei 59 campioni di semola rimacinata di grano duro ha
rilevato la presenza di contaminazione da spore di Bacillus nel 93,2% dei campioni.
In particolare, il 57,6% ha presentato un livello di contaminazione nell’ordine di
grandezza di 10 0 spore/g, il 13,6% di 10 1 spore/g, l’11,8% di 10 2 spore/g e il 10,2%
di 10 3 spore/g. I dati riportati in Tabella 3.3 non indicano una influenza relazione tra
varietà e livello di contaminazione, ma risulta evidente una variazione di
contaminazione nel tempo nell’ambito della stessa varietà. Con riferimento alla
tipologia tecnologica (semole o semole integrali), sembrerebbe esserci tendenza
alla maggiore presenza di Bacillus spp. in semole integrali rispetto alle semole della
corrispondente varietà negli anni 2006 e 2007. Il dato che risalta con maggiore
evidenza è il picco di incidenza delle specie sporigene nell’anno 2006. Dalla figura
3.1 si osserva una maggiore frequenza di campioni con una carica batterica di ca.
10 3 spore/g.
Un totale di 119 colonie, prelevate sulla base della diversa morfologia, sono
state trattate con una soluzione di iodio al fine di valutare la produzione di enzima β-
amilasi, responsabile dell’idrolisi dell’amido. Tutte le 119 colonie sono risultate
produrre l’enzima. Le colonie sono state successivamente caratterizzate mediante
la tecnica rep-PCR. Prove preliminari condotte su 11 isolati per definire le migliori
condizioni di amplificazione del DNA totale hanno indicato nell’ologonucleotide
(GTG)5 l’innesco in grado di fornire profili elettroforetici con il più elevato numero di
frammenti significativi ai fini della discriminazione dei diversi ceppi. La rep-PCR ha
permesso di individuare 31 profili (Tabella 3.1). I profili generati sono costituiti da un
numero di frammenti compreso tra 6 e 27, di dimensioni che vanno da 70 bp a 7 kb.
Un isolato rappresentativo di ciascun profilo rep è stato identificato tramite
sequenziamento di un frammento del gene 16S rRNA di circa 1400 bp. Le sequenze
ottenute hanno mostrato il 98-100% d’identità con quelle disponibili in banca dati,
permettendo di attribuire i diversi ceppi alle specie corrispondenti, tutte appartenenti
ai generi Bacillus e Paenibacillus. Le specie identificate sono state: B. subtilis/B.
amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. cereus/B. thuringensis, B. pumilus e B.
simplex e B. mojavensis. Per le specie B. subtilis/B. amyloliquefaciens e B.
cereus/B. thuringensis non è stato possibile ottenere un’identificazione univoca a
causa dell’elevato livello di similarità delle sequenze del 16S rDNA. Per i 12 isolati
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