TESI Dottorato FAVILLA MARA - Università degli Studi del Molise

min a 68°C. I prodotti di amplificazione sono stati visualizzati mediante elettroforesi
su gel all’1% (p/vol) di agarosio (Shelton Scientific) utilizzando il tampone TAE.
Come indicatore delle dimensioni dei frammenti di DNA è stato usato il marker Gel
Pilot 100 bp Plus Ladder (Qiagen). I prodotti di PCR sono stati purificati con il
QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) e poi quantificati tramite uno
spettrofotometro ND 1000 (NanoDrop Technologies).
I prodotti di PCR del 16S rRNA sono stati sequenziati impiegando gli
oligonucleotidi riportati in Tabella 2.2 ed utilizzando il BigDye TM Terminator cycle
sequencing kit (Applied Biosystems). Le reazioni di sequenza sono state condotte in
un volume di 5 µl contenenti circa 15 ng di DNA purificato, l’oligonucleotide alla
concentrazione 0,16 µM, 1 µl del tampone e 1 µl di mix del suddetto kit. La reazione
di sequenza è stata eseguita in un termociclatore GeneAmp PCR system 9700
(Perkin Elmer-Applied Biosystems) programmato come segue: 25 cicli di 10 secondi
a 96°C, 5 secondi a 50°C, 4 minuti a 60°C. I prodot ti di reazione sono stati purificati
utilizzando colonnine di Sephadex (5% p/vol, Sigma) ed analizzati con un
sequenziatore automatico ABI Prism 3100 (Applied Biosystems). Le sequenze del
gene 16S rRNA sono state confrontate con le sequenze depositate in banca dati
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) usando il programma BLAST N.
2.2.5 Identificazione molecolare di Lactobacillus plantarum
Per distinguere le specie L. plantarum e L. pentosus è stata condotta un’ulteriore
analisi basata sul metodo proposto da Torriani et al. (2001). Tre inneschi
pREV/planF/pentF sono stati usati per amplificare un frammento del gene recA.
Venticinque microlitri della miscela di PCR contenevano 2,5 µl del tampone 10 x
HotMaster TM Taq Buffer con Mg 2+ (2,5 mM), 0,2 mM dNTP Mix, 1,25 U HotMaster TM
Taq DNA Polymerase (Eppendorf AG, Hamburg, Germany), 0,25 µM degli inneschi
pREV e pentF, 0,12 µM dell’innesco planF e 1 µl di DNA totale rispettivamente dei
ceppi C21-41, L. pentosus ATCC 8041, L. plantarum ATCC 10012. Il ciclo di
amplificazione consisteva in: 94°C per 3 min, 30 ci cli di 30 sec a 94°C, 10 sec a
56°C, 30 sec a 68 °C, seguiti da 5 min a 68°C.I fra mmenti amplificati sono stati
visualizzati su gel di agarosio al 2% (p/vol) in presenza di uno standard (GelPilot 50
bp ladder Qiagen).
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