TESI Dottorato FAVILLA MARA - Università degli Studi del Molise

3.2 Materiali e metodi
3.2.1 Campioni di semole ed analisi microbiologica
Oggetto di studio sono stati 59 campioni di 200 g di semole rimacinate di grano duro
(Tabella 3.1). I campioni sono stati forniti da molini situati nella zona di Altamura e
Candela e sono relativi alle annate 2004-2005, 2005-2006 e 2006-2007. Le semole
durante il periodo di analisi sono state conservate a 4°C.
Per valutare la presenza di spore batteriche appartenenti al genere Bacillus 20
grammi di campione sono stati diluiti in 180 ml di una soluzione di Bacto-peptone
(0,1% p/vol) (Difco Lboratory Inc, Detroit, MI, USA). Dopo 30 min a temperatura
ambiente la sospensione è stata omogeneizzata per 2 min mediante Stomacher
Lab-Blender 400 (PBI International Milano, Italia). Successivamente una aliquota è
stata filtrata mediante carta Whatman N. 4 e sottoposta a trattamento termico
(90°C) per 20 min seguito da un rapido raffreddamen to in bagno di ghiaccio. Dalla
sospensione, concentrata 10 volte rispetto al volume iniziale, mediante
centrifugazione (10000 rpm per 10 min), sono state preparate le opportune diluizioni
decimali seriali in soluzione di cloruro di sodio (0,85% p/vol) e Tween 80 ed 1 ml è
stato inoculato in piastre di Starch-Agar (SA, Difco) per la semina con la tecnica
dell’inclusione. Dopo 24-48 h di incubazione a 30°C le colonie sono state
enumerate, prelevate e purificate mediante la tecnica dello striscio su SA. Ogni
isolato è stato sottoposto al test per la valutazione dell’attività amilasica con una
soluzione di iodio. (Hurrigan e McCance, 1976; Pepe et al., 2003). L’amido del
substrato (SA) nella forma non idrolizzata si colora di blu in presenza di una
soluzione di iodio, mentre quando viene idrolizzato dall’attività dell’enzima β-amilasi
prodotto dai batteri, assume una aspetto trasparente Infine le colonie che hanno
dimostrato attività amilasica sono state conservate a –80°C in Brain Heart Infusion
(BHI, Difco) al 20% di (vol/vol) di glicerolo.
3.2.2 Estrazione DNA genomico
Il DNA genomico è stato estratto da 2 ml di coltura inoculata in BHI ed incubata per
12 h a 30°C in agitazione. Il DNA è stato estratto utilizzando il kit commerciale della
Promega Corporation apportando alcune modifiche al protocollo indicato dalla ditta.
Tale estrazione si basa su quattro fasi principali: un prima fase di lisi cellulare, una
digestione dell’RNA presente, una terza fase che consiste nell’allontanamento delle
proteine cellulari mediante precipitazione con sali ed infine una quarta fase in cui il
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