TESI Dottorato FAVILLA MARA - Università degli Studi del Molise

amplificati visualizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio (2% p/vol). L’analisi
delle bande ha portato all’individuazione di 17 diversi profili elettroforetici, associabili
ad un numero di isolati compreso fra 1 e 18, caratterizzati da un insieme di
frammenti di numero e dimensioni diverse tale da fornire una “impronta digitale”
caratteristica per ciascun profilo.
Poiché gli isolati aventi un profilo elettroforetico uguale sono considerati cloni
di uno stesso individuo, per identificare le specie è stato amplificato il gene 16S
rRNA di un solo isolato per profilo. L’amplificazione ha prodotto un frammento di
circa 1400 bp la cui sequenza è stata confrontata con quelle presenti in banca dati.
Le sequenze ottenute hanno mostrato il 99-100% d’identità con quelle disponibili in
banca dati permettendo così l’identificazione delle seguenti specie batteriche:
Weissella cibaria, W. confusa, Leuconostoc citreum, L. mesenteroides, Lactococcus
lactis, Lactobacillus rossiae, L. plantarum/L. pentosus.
Il confronto della sequenza del gene 16S rRNA del ceppo C21-41 con quelle
depositate in banca dati non ha permesso l’identificazione univoca della specie, in
quanto il frammento amplificato è risultato avere un’identità del 100% sia con L.
plantarum che con L. pentosus, è stata quindi eseguita un’ulteriore indagine al fine
di ottenere l’identificazione esatta del ceppo. La Figura 2.1 mostra l’amplificazione
del DNA totale del ceppo C21-41 con la miscela dei tre oligonucleotidi disegnati
sulla sequenza del gene recA, che ha prodotto un frammento di 318 bp
corrispondente alla specie L. plantarum. Successivamente i 17 profili sono stati
analizzati utilizzando il coefficiente di similarità Dice (SD) e l’algoritmo UPGMA,
ottenendo così il dendrogramma riportato in Figura 2.2. L’identificazione delle specie
a cui appartengono gli isolati caratterizzati dai 17 diversi profili rep che compongono
il dendrogramma di similarità ha messo in evidenza come otto dei 17 diversi profili
(I-P, Figura 2.2) sono associati a isolati di W. cibaria. Essi sono raggruppati con un
livello del coefficiente di similarità circa del 50% e sono chiaramente distinti dagli
isolati di W. confusa (C, D e E) che si raggruppano tra loro ad un livello di similarità
circa del 55%. Il gruppo di W. cibaria è unito a L. mesenteroides (Q) e a L. citreum
(G) e L. rossiae (H) a un livello del coefficiente di similarità di circa il 46% e il 30%,
rispettivamente. L. plantarum e L. lactis (profili A, B, F) sulla base dei loro profili
sono raggruppati con W. confusa. Il confronto dei risultati ottenuti mediante rep-PCR
insieme all’analisi delle sequenze hanno dimostrato che i batteri lattici isolati più
frequentemente dalle semole analizzate appartengono al genere Weissella. Infatti
W. confusa e W. cibaria sono state entrambe isolate da sei differenti campioni,
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