TESI Dottorato FAVILLA MARA - Università degli Studi del Molise

lineare del gradiente del solvente A dal 10% al 30% in 16 min, seguita da
un’eluizione isocratica al 30% di A per 5 min., e infine da una variazione lineare del
gradiente del solvente A dal 30% al 60% in 6 min. con una velocità di flusso di 1
ml/min. Il cromatografo è dotato di rivelatore UV a tre canali (Amersham
Biosciences 900, Uppsala, Sweden) che ha consentito di misurare
contemporaneamente PLA (210 nm) e OH-PLA (220 nm). I limiti di quantificazione
per PLA e OH-PLA sono 1,49 e 0,27 µg. Le quantità di PLA e OH-PLA sono state
calcolate integrando i picchi cromatografici in funzione delle curve di calibrazione
ottenute con soluzioni standard dei composti puri.
2.2.9 Attività antifungina in vitro dei prodotti di fermentazione
L’attività antifungina dei PF è stata valutata su due muffe, Aspergillus niger ITEM
5132, Penicillium roqueforti IBT 18687, e un lievito, Endomyces fibuliger IBT 605,
isolati da prodotti da forno. I microrganismi ITEM provengono dalla collezione
dell’Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari CNR di Bari e quelli IBT dalla
collezione dell’Università Tecnologica della Danimarca (IBT).
Preparazione dell’inoculo di spore fungine. I tre ceppi sono stati inoculati su
Potato Dextrose Agar (PDA, Difco) e le piastre incubate per 7 giorni a 25°C. Le
spore fungine e le cellule del lievito sono state sospese in Triton X-100 0,05%
(vol/vol), la sospensione è stata centrifugata due volte (10.000 rpm per 7 min.) e il
pellet è stato risospeso in 100 µl di acqua sterile. Un’aliquota di 50 µl della
sospensione è stata inoculata mediante piastramento su PDA. Dopo incubazione
delle piastre a 25 °C per 3 giorni le spore o le ce llule sono state sospese in Triton-X-
100 0,05% (vol/vol). La concentrazione delle sospensioni è stata determinata con un
emocitometro (cella di Thoma) e portata al valore di 5×10 4 spore o cellule per ml.
Saggio di attività antifungina. L’attività antifungina dei prodotti di
fermentazione è stata determinata mediante il saggio in piastre a 96 pozzetti
descritto da Lavermicocca et al. (2003). In breve, 10 µl della sospensione di spore
(muffe) o di cellule (lievito) (5×10 2 ) sono stati aggiunti in triplicato a 190 µl di PF
(PFi) o di substrato WHF (WHFi) contenente o no propionato di calcio 0,3% (p/vol).
Sono stati allestiti in triplicato i controlli non inoculati contenenti 190 µl di PF o
substrato WHF + 10 µl di Triton-X-100 0,05% (vol/vol) (PFni o WHFni,
rispettivamente). Le piastre sono state incubate per 96 h in una camera umida a 25
°C. La crescita fungina è stata monitorata ogni 24 h per 4 giorni mediante lettura
spettrofotometrica (Labsystem, Multiskan MS, Version 3.0, tipo 352) a 580 nm
42