Ataxie mit okulomotorischer Apraxie Typ 2: Charakterisierung des ...

Methoden 14
3.2 Methoden
3.2.1 Probenauswahl
Für diese Arbeit standen 79 in unserem Institut extrahierte DNA-Proben von nicht
verwandten Ataxie-Patienten zur Verfügung. Bei diesen Patienten wurden Mutationen im
FXN-Gen, die mit der Friedreich-Ataxie assoziiert sind, bereits ausgeschlossen. Aufgrund
der früh beginnenden Symptomatik bei der AOA2 wurden Patienten mit einem
Erkrankungsalter unter 30 Jahren ausgewählt. Bei einigen Patienten war ein weiteres
Einschlusskriterium neben dem Verdacht auf einen rezessiven Erbgang in der Familie ein
erhöhter -Fetoproteinspiegel im Serum der Patienten.
3.2.2 Sequenzanalyse
3.2.2.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR; „polymerase chain reaction“) ist eine effektive
Methode, spezifische DNA-Abschnitte zu amplifizieren. Für diese Methode werden dNTPs
(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), eine hitzebeständige Polymerase, zwei Primer und DNA als
Template benötigt. Primer sind kurze Oligonukleotide, die der zu amplifizierenden DNA-
Sequenz an beiden 3’-Enden komplementär sind. Im ersten Schritt der PCR, der
Denaturierung, wird der zu amplifizierende Doppelstrang bei einer Temperatur von ca.
94°C in seine Einzelstränge aufgeschmolzen, damit sich im zweiten Schritt, dem
Annealing, die Primer an die Einzelstränge anlagern können. Die optimale Annealing-
Temperatur der Primer hängt von der Basenzusammensetzung AT:GC ab und liegt meist in
einem Temperaturbereich von 54 bis 65°C. Im dritten Schritt, der Extension, wird bei einer
Temperatur von 72°C die Taq DNA-Polymerase aktiv und synthetisiert einen zweiten
Strang, der komplementär zum Template ist. Diese drei Schritte werden zyklisch
wiederholt, wobei in jedem Zyklus die Anzahl der DNA-Kopien verdoppelt wird.
Die Amplifikation der Exons 2 bis 26 des SETX-Gens wurde mit Hilfe der Standard Taq
DNA-Polymerase der Firma Qbiogene durchgeführt. Die verwendeten Reaktionsgemische
enthielten in einem Volumen von 25 µl 50 ng genomische DNA, 0,5 bzw. 0,25 U Taq
DNA-Polymerase, 10% (v/v) Taq-Puffer, jeweils 5 nmol der Nukleotide sowie 10 pmol
bzw. 5 pmol von jedem der beiden Primer (Tabelle 4 a, b und c, S. 9-11). Die
Reaktionsansätze wurden zunächst für 5 min bei 94°C denaturiert. Anschließend folgten
die PCR-Zyklen mit einer Zyklenanzahl zwischen 30 und 35. Die Denaturierung im PCR-