Ataxie mit okulomotorischer Apraxie Typ 2: Charakterisierung des ...

Ergebnisse 30
Für die weitere Untersuchung standen DNA- und RNA-Proben der Eltern (Mutter M8 und
Vater V8) von Patient P8 zur Verfügung. In der maternalen DNA wurde die Nonsense-
Mutation p.R1606X in heterozygoter Form detektiert. In der paternalen DNA konnte das
~1,6 kb große PCR-Produkte der Long-range-PCR nachgewiesen werden, während in der
maternalen DNA nur das Wildtyp-Fragment gefunden wurde (Abb. 6a, S. 30). Die
Sequenzierung bestätigte, dass der Vater V8 heterozygoter Träger der ~1,3 kb-Insertion ist.
Abb. 6: L1HS-Insertion
(a) 0,8%iges Agarosegel. Gezeigt sind die Long-range-PCR-Produkte für Patient P8, für
die Mutter M8 und für den Vater V8. Marker: 100 bp-Längenstandard. Die Bande bei 354
bp stellt den Wildtyp dar und das 1634 bp-Fragment zeigt das PCR-Produkt mit der ~1,3
kB-Insertion.
(b) Schematische Darstellung der L1HS-Insertion. Die schwarzen Kästchen stellen die 15
bp duplizierte Region dar. Die Pfeile geben die Orientierung des L1HS-Elements an, der
erste Teil ist bezogen auf das SETX-Gen in Antisense-Orientierung, der zweite Teil in
Sense-Orientierung angeordnet.
RNA-Analyse P8
Um den Effekt der Insertion auf mRNA-Ebene zu untersuchen, wurde eine RT-PCR
durchgeführt. Aus RNA-Proben von Patient P8, seiner Eltern und einer Kontrollperson
wurde cDNA für Exon 11 bis 13 synthetisiert (Tabelle 6, S. 11) und anschließend auf ein
0,8%iges Agarosegel aufgetragen. Die RT-PCR führte bei der Mutter (M8) und bei der
Kontroll-RNA (C) zu einem 416 bp großen Fragment (Fragment 1, Abb. 7a und 7b, S. 31).
Dieses Transkript enthält das vollständige Exon 12. Die RT-PCR-Produkte für Patient P8
und den Vater V8 ließen sich neben dem Fragment 1 in zwei zusätzliche Transkripte mit
einer Länge von 350 bp und 242 bp auftrennen (Fragment 2 und 3, Abb. 7a und 7b, S. 31).
Die Klonierung und Sequenzierung dieser Transkripte ergab, dass dem 350 bp-Transkript
die ersten 66 bp von Exon 12 fehlen, während bei dem 242 bp-Transkript das komplette
Exon 12 deletiert ist. Das Fehlen der 66 Basen führt auf Protein-Ebene zu einem Protein