Ataxie mit okulomotorischer Apraxie Typ 2: Charakterisierung des ...

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Ergebnisse 28 Abb. 4: RNA-Analysen für die Spleißmutation bei Patient P7. (a) 8%iges PAA-Gel der RT-PCR-Produkte von Patient P7. M: Marker pBR322 Msp I digest. Die Kontrollprobe C zeigt eine Bande bei 140 bp, während die Probe von Patient P7 eine zusätzliche Bande mit einer Größe von 136 bp aufweist. (b) Oben ist die Wildtyp-Sequenz (WT) dargestellt. Die untere Sequenz zeigt die Deletion und die Leserasterveränderung. Abb. 5: Beispiel für einen heterozygoten Basenaustausch. Gezeigt ist ein Ausschnitt aus Exon 10 des SETX-Gens. (a) Sequenz des Patienten P8, der an der Nukleotid-Position 4816 des SETX-Gens heterozygot für die Basen Cytosin und Thymin ist (c.4816C>T). (b) Wildtyp-Sequenz.
Ergebnisse 29 Real-Time-PCR P8 Da bei diesem Patienten mit Hilfe der Sequenzierung keine weitere Veränderung im SETX- Gen gefunden werden konnte, wurde zusätzlich eine Real-Time-PCR der einzelnen Exons an genomischer DNA durchgeführt. Diese lieferte den Hinweis, dass Exon 12 im Vergleich zu den anderen Exons des Gens in einer geringeren Menge amplifiziert wird. Long-range-PCR P8 Die anschließend durchgeführte Long-range-PCR mit Primern, die das Exon 12 flankieren (siehe Tabelle 7, S. 12), führte neben dem Wildtyp-Fragment mit einer Größe von 354 bp (Fragment 2) zu einem ~1,6 kb großen PCR-Produkt (Fragment 1, Abb. 6a, S. 30). Die Sequenzierung dieses zusätzlichen PCR-Produktes zeigte eine ~1,3 kb-Insertion in Exon 12 des SETX-Gens (c.5401_5402ins1280bp). Dieses ~1,3 kb große Fragment ist nach Nukleotid 26 in Exon 12 des SETX-Gens inseriert. Zusätzlich liegen die 15 Nukleotide vor der Insertion in duplizierter Form vor und flankieren die Insertion somit. Weiter enthält die Insertion einen großen PolyA-Bereich. Deshalb konnte die Sequenzierung mit dem Vorwärts- und dem Rückwärtsprimer jeweils nur bis zu diesem PolyA-Bereich erfolgen. Aufgrund der Größe des PCR-Produktes (Abb. 6a, S. 30) kann jedoch davon ausgegangen werden, dass außer der exakten Länge der PolyA-Region die Sequenz vollständig bestimmt werden konnte. Datenbankabgleich P8 Zur Identifizierung dieser Insertion wurde ein Datenbankabgleich mit dem BLASTN- Programm auf der NCBI-Homepage durchgeführt (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Das BLASTN-Programm gleicht eine Nukleotidsequenz gegen eine Nukleotidsequenzdatenbank ab. Für die Insertion lieferte dieser Sequenzabgleich sehr viele Treffer nahezu überall im menschlichen Genom. Aus diesem Grund wurde die Insertion mit dem RepeatMasker-Programm, einem Programm zur Bestimmung repetitiver Elemente, genauer analysiert (http://www.repeatmasker.org). Diese Analyse wies darauf hin, dass es sich bei der Insertion um ein LINE1-Element handelt. Der Vergleich mit mehreren LINE1- Elementen wiederum zeigte, dass die Insertion aus einem am 5’-Ende verkürzten L1HS- Element besteht, wobei der erste Teil des Elements bezogen auf das SETX-Gen in Antisense-Orientierung und der zweite Teil in Sense-Orientierung angeordnet ist. Eine schematische Darstellung dieser Insertion ist in Abb. 6b gezeigt.
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