Ataxie mit okulomotorischer Apraxie Typ 2: Charakterisierung des ...

Methoden 18
3.2.3.2 MLPA
Die MLPA-Analyse (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplifikation) ist eine
quantitative Methode zur Detektion von Dosisunterschieden von bis zu 50 verschiedenen
Nukleinsäurefragmenten in einem Reaktionsansatz.
Für die MLPA-Analyse wurde das SALSA MLPA KIT P316-B1 der Firma MRC-Holland
verwendet. Dieses Kit beinhaltet einen Sondenmix für die Exons der Gene FRX, SETX und
APTX, d.h. in einem Reaktionsansatz können Gendosisunterschiede für die drei rezessiven
Ataxien, die Friedreich-Ataxie, die AOA2 und die AOA1, getestet werden.
Die Durchführung der MLPA-Analyse erfolgte gemäß der Angaben des Herstellers. Im
ersten Schritt fand die Hybridisierung der Sonden an die spezifische Sequenz der
genomischen DNA statt. Nach der Hybridisierung wurden die Sonden ligiert und
anschließend wurde eine PCR-Reaktion durchgeführt. Die Amplifikationsprodukte wurden
nach Angaben des Herstellers mit dem Illustra Sephadex G-50-System von GE Healthcare
aufgereinigt und zusammen mit dem GENESCAN 400 HD [ROX] Size Standard (Applied
Biosystems Inc.) mit Hilfe des Kapillarsequenzers 3100-Avant Genetic Analyser (Applied
Biosystems Inc.) aufgetrennt. Die Ergebnisse wurden mit dem Programm SEQUENCE
Pilot module MLPA Version 3.3 der Firma JSI medical systems GmbH (http://www.jsimedisys.com
) ausgewertet.
3.2.3.3 Bruchpunktbestimmung
Zur Bestimmung der Bruchpunkte wurde eine Long-range-PCR mit dem Expand High
Fidelity PCR System (Roche Diagnostics GmbH) durchgeführt. Hierfür wurden Primer
verwendet, die die potentiellen Deletionen flankieren. Konnte mittels Long-range-PCR
kein PCR-Produkt erhalten werden, so wurden die Introns 5’ und 3’ der Deletionen durch
Primer-Walking näher untersucht. Zu diesem Zweck wurden Primerpaare entworfen, die
etwa 200 bp große PCR-Produkte hervorrufen. Mit Hilfe dieser Primer erfolgte erneut eine
Real-Time-PCR mit SYBR-Green und die Quantität der PCR-Produkt wurde mit dem
REST version2-Programm berechnet (siehe 3.2.3.1). Lieferte die Berechnung einen
Hinweis auf das Vorhandensein beider Allele, wurden neue Primerpaare generiert, die
„näher“ an der Bruchstelle liegen. Letztendlich wurden die Deletionen durch eine
bruchpunktüberspannende PCR mit der Standard-Polymerase (Qbiogene) auf genomischer
Ebene verifiziert. Die Primersequenzen sind in Tabelle 7 aufgeführt.