Ataxie mit okulomotorischer Apraxie Typ 2: Charakterisierung des ...

Ergebnisse 29
Real-Time-PCR P8
Da bei diesem Patienten mit Hilfe der Sequenzierung keine weitere Veränderung im SETX-
Gen gefunden werden konnte, wurde zusätzlich eine Real-Time-PCR der einzelnen Exons
an genomischer DNA durchgeführt. Diese lieferte den Hinweis, dass Exon 12 im Vergleich
zu den anderen Exons des Gens in einer geringeren Menge amplifiziert wird.
Long-range-PCR P8
Die anschließend durchgeführte Long-range-PCR mit Primern, die das Exon 12 flankieren
(siehe Tabelle 7, S. 12), führte neben dem Wildtyp-Fragment mit einer Größe von 354 bp
(Fragment 2) zu einem ~1,6 kb großen PCR-Produkt (Fragment 1, Abb. 6a, S. 30). Die
Sequenzierung dieses zusätzlichen PCR-Produktes zeigte eine ~1,3 kb-Insertion in Exon
12 des SETX-Gens (c.5401_5402ins1280bp). Dieses ~1,3 kb große Fragment ist nach
Nukleotid 26 in Exon 12 des SETX-Gens inseriert. Zusätzlich liegen die 15 Nukleotide vor
der Insertion in duplizierter Form vor und flankieren die Insertion somit. Weiter enthält die
Insertion einen großen PolyA-Bereich. Deshalb konnte die Sequenzierung mit dem
Vorwärts- und dem Rückwärtsprimer jeweils nur bis zu diesem PolyA-Bereich erfolgen.
Aufgrund der Größe des PCR-Produktes (Abb. 6a, S. 30) kann jedoch davon ausgegangen
werden, dass außer der exakten Länge der PolyA-Region die Sequenz vollständig bestimmt
werden konnte.
Datenbankabgleich P8
Zur Identifizierung dieser Insertion wurde ein Datenbankabgleich mit dem BLASTN-
Programm auf der NCBI-Homepage durchgeführt (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Das
BLASTN-Programm gleicht eine Nukleotidsequenz gegen eine Nukleotidsequenzdatenbank
ab. Für die Insertion lieferte dieser Sequenzabgleich sehr viele Treffer nahezu
überall im menschlichen Genom. Aus diesem Grund wurde die Insertion mit dem
RepeatMasker-Programm, einem Programm zur Bestimmung repetitiver Elemente,
genauer analysiert (http://www.repeatmasker.org). Diese Analyse wies darauf hin, dass es
sich bei der Insertion um ein LINE1-Element handelt. Der Vergleich mit mehreren LINE1-
Elementen wiederum zeigte, dass die Insertion aus einem am 5’-Ende verkürzten L1HS-
Element besteht, wobei der erste Teil des Elements bezogen auf das SETX-Gen in
Antisense-Orientierung und der zweite Teil in Sense-Orientierung angeordnet ist. Eine
schematische Darstellung dieser Insertion ist in Abb. 6b gezeigt.