Ataxie mit okulomotorischer Apraxie Typ 2: Charakterisierung des ...

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Ergebnisse 30 Für die weitere Untersuchung standen DNA- und RNA-Proben der Eltern (Mutter M8 und Vater V8) von Patient P8 zur Verfügung. In der maternalen DNA wurde die Nonsense- Mutation p.R1606X in heterozygoter Form detektiert. In der paternalen DNA konnte das ~1,6 kb große PCR-Produkte der Long-range-PCR nachgewiesen werden, während in der maternalen DNA nur das Wildtyp-Fragment gefunden wurde (Abb. 6a, S. 30). Die Sequenzierung bestätigte, dass der Vater V8 heterozygoter Träger der ~1,3 kb-Insertion ist. Abb. 6: L1HS-Insertion (a) 0,8%iges Agarosegel. Gezeigt sind die Long-range-PCR-Produkte für Patient P8, für die Mutter M8 und für den Vater V8. Marker: 100 bp-Längenstandard. Die Bande bei 354 bp stellt den Wildtyp dar und das 1634 bp-Fragment zeigt das PCR-Produkt mit der ~1,3 kB-Insertion. (b) Schematische Darstellung der L1HS-Insertion. Die schwarzen Kästchen stellen die 15 bp duplizierte Region dar. Die Pfeile geben die Orientierung des L1HS-Elements an, der erste Teil ist bezogen auf das SETX-Gen in Antisense-Orientierung, der zweite Teil in Sense-Orientierung angeordnet. RNA-Analyse P8 Um den Effekt der Insertion auf mRNA-Ebene zu untersuchen, wurde eine RT-PCR durchgeführt. Aus RNA-Proben von Patient P8, seiner Eltern und einer Kontrollperson wurde cDNA für Exon 11 bis 13 synthetisiert (Tabelle 6, S. 11) und anschließend auf ein 0,8%iges Agarosegel aufgetragen. Die RT-PCR führte bei der Mutter (M8) und bei der Kontroll-RNA (C) zu einem 416 bp großen Fragment (Fragment 1, Abb. 7a und 7b, S. 31). Dieses Transkript enthält das vollständige Exon 12. Die RT-PCR-Produkte für Patient P8 und den Vater V8 ließen sich neben dem Fragment 1 in zwei zusätzliche Transkripte mit einer Länge von 350 bp und 242 bp auftrennen (Fragment 2 und 3, Abb. 7a und 7b, S. 31). Die Klonierung und Sequenzierung dieser Transkripte ergab, dass dem 350 bp-Transkript die ersten 66 bp von Exon 12 fehlen, während bei dem 242 bp-Transkript das komplette Exon 12 deletiert ist. Das Fehlen der 66 Basen führt auf Protein-Ebene zu einem Protein
Ergebnisse 31 bei dem 22 Aminosäuren deletiert sind (p.V1792_L1813del). Das Transkript mit der Deletion des kompletten Exons 12 kodiert ein Protein, bei dem anstatt der Aminosäure- Sequenz zwischen den Positionen 1792 und 1850 ein Valin inseriert ist, also zu einem 58 Aminosäuren kürzeren Protein (p.V1792_M1850delinsV). Beide Transkripte kodieren also ein verkürztes Protein, dessen ursprüngliches Leseraster jedoch erhalten bleibt. Abb. 7: Transkriptanalyse für 4 Patienten und Angehörige 1. Grades (a) 0,8%iges Agarosegel mit den RT-PCR-Produkten. Marker: 100 bp-Längenstandard, 1-9: RT-PCR-Produkte, P: Patient, M: Mutter, V: Vater, S: Schwester, C: Kontrolle. (b) Schematische Darstellung der unterschiedlichen Transkripte.
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