Ataxie mit okulomotorischer Apraxie Typ 2: Charakterisierung des ...

Methoden 20
wurden auf das Gel aufgetragen. Die Elektrophorese lief bei 30 W für 2,5 Stunden. Nach
der Gelelektrophorese wurde eine Silberfärbung der Gele durchgeführt, um die Banden auf
dem Gel sichtbar zu machen. Für den Färbevorgang wurden jeweils 300 ml der einzelnen
Färbelösungen auf das Gel gegeben. Im ersten Schritt wurde das Gel für 10 min mit
10%igem Ethanol und für 5 min mit 1%iger Salpetersäure fixiert und anschließend dreimal
mit destilliertem Wasser gespült. Dann folgte für 20 min die Färbung mit Silbernitrat (2,02
g AgNO 3 /l). Nach der Färbung wurde das Gel erneut zweimal mit destilliertem Wasser
gespült. Anschließend wurden 500 ml der Reduktionslösung (29,6 g Na 2 CO 3 /l) mit 300 µl
Formaldehyd auf das Gel gegeben, und es wurde solange entwickelt, bis Banden auf dem
Gel zu erkennen waren. Die Entwicklung des Gels wurde durch Zugabe von 10%iger
Essigsäure für 3 min gestoppt.
3.2.4.3 Klonierung der RT-PCR-Produkte
Ligation
Die Ligation der RT-PCR-Produkte mit dem pGEM T Easy-Vektor erfolgte gemäß der
Angaben des Herstellers mit dem pGEM T Easy Vektor System I (Promega) für 1 h bei
Raumtemperatur (RT).
Ligationsansatz (10 µl):
2x-Puffer 5,0 µl
pGEM Vektor 0,5 µl (25 ng)
T-Ligase 1,0 µl
RT-PCR-Produkt 3,5 µl
Transformation
Für die Transformation wurden 5 µl des Ligationsansatzes zu 50 µl kompetenten Zellen
(E. coli Stamm DH5) gegeben und für 10 min auf Eis inkubiert. Anschließend erfolgte
ein Hitzeschock bei 42°C für 2 min. Nach einer erneuten Inkubation für 2 min auf Eis
wurde 450 µl LB-Medium hinzu gegeben. Daraufhin wurde eine einstündige Inkubation
im Schüttler bei 37°C (225 rpm) durchgeführt.