Ataxie mit okulomotorischer Apraxie Typ 2: Charakterisierung des ...

Methoden 17
angeregt. Die Abfolge der Farbsignale, die an einem Detektor erscheinen, gibt nun die
Basenabfolge des sequenzierten DNA-Abschnittes wieder.
In der vorliegenden Arbeit wurden die PCR-Produkte vor der DNA-Sequenzierung mit
einem Enzymgemisch aus Exonuklease I und Shrimp Alkaline Phosphatase behandelt
(ExoSAP IT). Dieses Enzymgemisch dient aufgrund seiner Exonuklease- und Phosphatase-
Funktion dazu, die PCR-Produkte von überschüssigen Primern- und Nukleotidtriphosphatresten
zu befreien, welche die Sequenzreaktion stören würden. Der
Sequenzansatz enthielt in einem Volumen von 10 µl 5-10 ng des vorbehandelten DNA-
Moleküls bzw. der Plasmid-DNA, 15% (v/v) Sequenz-Puffer, 10% (v/v) Big Dye
Terminator v1.1 (Applied Biosystems Inc.) und 5 pmol des jeweiligen Primers. Für
besonders große PCR-Produkte wurden bei der Sequenzierung zusätzliche Primer
verwendet (Tabelle 5, S. 11). Die Sequenzreaktion wurde bei 96°C für 1 min gefolgt von
25 Zyklen mit 96°C für 10 sek und 60°C für 1 min durchgeführt. Die Aufreinigung der
Sequenz-Produkte erfolgte nach Angaben des Herstellers mit dem Illustra Sephadex G-50
von GE Healthcare. Anschließend wurden die Proben mit HiDi-Formamid verdünnt und
mit dem Kapillar-Sequenzer ABI 3130 xl Genetic Analyser (Applied Biosystems Inc.)
sequenziert. Die Auswertung der Sequenzen erfolgte mit der Software SeqScape v2.5
(Applied Biosystems Inc.).
3.2.3 Quantitative Analysen und Bruchpunktbestimmung
3.2.3.1 Real-Time-PCR mit SYBR-Green
Die Real-Time-PCR beruht auf der herkömmlichen PCR-Methode und dient der
Quantifizierung von Nukleinsäuren. Mit Hilfe von Fluoreszenz-Messungen wird während
der PCR-Zyklen die Menge der entstandenen PCR-Produkte bestimmt.
Die Real-Time-PCR wurde in Anwesenheit von SYBR-Green (SYBR-Green I core reagent
kit including Ampli-Taq-Gold polymerase; Applied Biosystems Inc.) durchgeführt. Die
verwendeten Reaktionsgemische enthielten in einem Volumen von 25 µl 25 ng
genomische DNA und 10 pmol von jedem der beiden Primer. Ansonsten erfolgte die PCR-
Reaktion gemäß der Angaben des Herstellers, auf dem ABI 7300 Real Time PCR System
(Applied Biosystems Inc.). Die verwendeten Primer sind in Tabelle 4 aufgeführt und
entsprechen den Primern für die Sequenzanalyse des SETX-Gens. Die Ergebnisse der Real-
Time-PCR wurden mit dem REST-version2-Programm (M.W. Pfaffl, http://www.genequantification.de)
berechnet und ausgewertet.