Ataxie mit okulomotorischer Apraxie Typ 2: Charakterisierung des ...

Methoden 22
der Firma Qbiogene und einem FAM-markierten M13-Primer (5’-cacgacgttgtaaaacgac-3’).
Die verwendeten Reaktionsgemische enthielten in einem Volumen von 25 µl 50 ng
genomische DNA, 0,75 U Taq DNA-Polymerase, 10% (v/v) Taq-Puffer, jeweils 5 nmol
der Nukleotide, 10 pmol der beiden Primer, sowie 1,5 pmol des M13-FAM-Primers. Die
Reaktionsansätze wurden zunächst für 5 min bei 95°C denaturiert. Anschließend folgten
die 35 PCR-Zyklen: 94°C für 30 sek, 55°C für 30 sek, 72°C für 30 sek. Abgeschlossen
wurde die Reaktion mit einer weiteren Extensionsphase von 7 min bei 72°C. Nach der
PCR-Reaktion wurden die PCR-Produkte nach Angaben des Herstellers mit dem Illustra
Sephadex G-50-System von GE Healthcare aufgereinigt und zusammen mit dem
GENESCAN 400 HD [ROX] Size Standard (Applied Biosystems) mit Hilfe des
Kapillarsequenzers 3100-Avant Genetic Analyser (Applied Biosystems) aufgetrennt. Die
Ergebnisse wurden mit dem Programm Cyrillic.210 (http://www.cyrillicsoftware.com)
ausgewertet.