Ataxie mit okulomotorischer Apraxie Typ 2: Charakterisierung des ...

Methoden 16
3.2.2.2 Agarose-Gelelektrophorese
Die Agarose-Gelelektrophorese ist eine einfache Methode, DNA-Fragmente aufzutrennen.
Das Prinzip der Agarose-Gelelektrophorese beruht darauf, Moleküle auf ein Träger-Gel
aufzutragen und mit Hilfe eines elektrischen Feldes nach Form, Größe und Ladung
aufzutrennen. Die DNA trägt eine negative Ladung und wandert im elektrischen Feld zur
Anode. Zur Größenbestimmung der DNA-Fragmente wird ein Längenstandard mitgeführt.
Die Agarosegellösung wird mit Ethidiumbromid versetzt. Ethidiumbromid ist ein DNAinterkalierender
Fluoreszenzfarbstoff, mit dessen Hilfe die doppelsträngigen DNA-
Fragmente markiert und unter UV-Licht sichtbar gemacht werden.
In der vorliegenden Arbeit wurden 0,8%-2%ige Standard-Agarosegele verwendet. Die
Gele wurden mit einem Proben-Farbgemisch bestehend aus 4 µl PCR-Produkt und 3 µl
3xFicoll-Farbe beladen. Zusätzlich wurden 2 µl eines Markers (Low DNA Mass Ladder)
zur Größen- und Konzentrationsbestimmung der jeweiligen PCR-Produkte auf das Gel
aufgetragen. Die Gelelektrophorese wurde für 30 min bei 110 V durchgeführt.
3.2.2.3 DNA-Sequenzierung
Die DNA-Sequenzierung ist eine Methode zur Bestimmung der genauen Nukleotid-
Abfolge in einem DNA-Molekül. Die in der vorliegenden Arbeit verwendete
Sequenziermethode ist die Didesoxymethode nach Sanger, welche auch als Kettenabbruch-
Synthese bezeichnet wird. Das Prinzip dieser Methode beruht darauf, dass DNA-
Polymerase an Einzelstrang-DNA von einem Primer aus einen neuen DNA-Strang
synthetisieren kann. Diese Synthese erfolgt in Gegenwart von Nukleotidtriphosphaten,
denen in niedriger Konzentration Didesoxynukleotide, d.h. Nukleotide, denen die 3’-OH-
Gruppe an der Desoxyribose fehlt, beigefügt sind. Es kommt unter diesen Bedingungen zu
einem Abbruch der DNA-Synthese, sobald ein Didesoxynukleotid in den
neusynthetisierten Strang eingebaut wird, da aufgrund der fehlenden 3’-OH-Gruppe der
Desoxyribose die DNA-Polymerase kein weiteres Nukleotid anfügen kann. Die vier
verschiedenen Didesoxynukleotide sind jeweils mit einem unterschiedlichen Fluoreszenz-
Farbstoff markiert. Der Einbau der fluoreszenz-markierten Didesoxynukleotide erfolgt
zufällig, so dass eine Mischung von neusynthetisierten DNA-Strängen unterschiedlicher
Länge entsteht. Die entstehenden Kettenabbruch-Produkte werden mittels Kapillar-
Gelelektrophorese nach ihrer Größe aufgetrennt und mit Hilfe eines Lasers zur Fluoreszenz