Ataxie mit okulomotorischer Apraxie Typ 2: Charakterisierung des ...
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Methoden 15<br />
Zyklus erfolgte bei 94°C für 30 sek. Das Annealing wurde abhängig von dem jeweiligen<br />
zu amplifizierenden Genabschnitt bei einer Temperatur zwischen 50°C und 60°C für 30<br />
sek durchgeführt. Für den dritten Schritt <strong>des</strong> PCR-Zyklus, der Extension, wurden bei einer<br />
Temperatur von 72°C Extensionszeiten von 30 sek bzw. 60 sek verwendet. Abgeschlossen<br />
wurde die Reaktion <strong>mit</strong> einer weiteren Extensionsphase von 7 min bei 72°C.<br />
Die Unterschiede bei der Amplifizierung der einzelnen Genabschnitte in dieser Arbeit sind<br />
als Übersicht in Tabelle 9 zusammengefasst.<br />
Der 5’-UTR-Bereich und das Exon 1 <strong>des</strong> SETX-Gens wurden <strong>mit</strong> den Primern SETX-E1-F<br />
(5’-gcgagggatttactctgctgtgttg-3’) und SETX-E1-R (5’-gcagtgtagacaacggaaggacagg-3’) in<br />
einem Fragment amplifiziert. Die PCR wurde <strong>mit</strong> dem GC-RICH PCR System gemäß der<br />
Angaben <strong>des</strong> Herstellers (Roche) durchgeführt.<br />
Tabelle 9: PCR-Bedingungen für die Exons 2 bis 26 <strong>des</strong> SETX-Gens<br />
SETX-Gen Annealingtemperatur<br />
Extensionszeit<br />
Zyklenanzahl<br />
Polymerase-<br />
Konzentration<br />
Primer-<br />
Konzentration<br />
Exon 2 60°C 30 sek 30 0,25 U 10 pmol<br />
Exon 3 55°C 30 sek 30 0,50 U 10 pmol<br />
Exon 4 55°C 30 sek 30 0,50 U 10 pmol<br />
Exon 5 60°C 60 sek 30 0,50 U 10 pmol<br />
Exon 6 55°C 30 sek 30 0,25 U 10 pmol<br />
Exon 7 60°C 60 sek 30 0,50 U 10 pmol<br />
Exon 8 60°C 60 sek 30 0,25 U 10 pmol<br />
Exon 9 50°C 30 sek 30 0,50 U 10 pmol<br />
Exon 10-1 60°C 60 sek 30 0,25 U 10 pmol<br />
Exon 10-2 60°C 60 sek 30 0,25 U 10 pmol<br />
Exon 10-3 60°C 60 sek 30 0,25 U 10 pmol<br />
Exon 10-4 60°C 60 sek 30 0,25 U 10 pmol<br />
Exon 10-5 60°C 60 sek 30 0,25 U 10 pmol<br />
Exon 10-6 60°C 60 sek 30 0,25 U 10 pmol<br />
Exon 10-7 60°C 60 sek 30 0,25 U 10 pmol<br />
Exon 11 55°C 30 sek 30 0,25 U 10 pmol<br />
Exon 12 55°C 30 sek 30 0,50 U 10 pmol<br />
Exon 13 55°C 30 sek 30 0,25 U 10 pmol<br />
Exon 14 55°C 30 sek 30 0,25 U 10 pmol<br />
Exon 15 60°C 60 sek 30 0,50 U 10 pmol<br />
Exon 16 60°C 60 sek 30 0,25 U 10 pmol<br />
Exon 17 55°C 30 sek 30 0,50 U 10 pmol<br />
Exon 18 60°C 60 sek 30 0,50 U 10 pmol<br />
Exon 19 60°C 60 sek 30 0,50 U 10 pmol<br />
Exon 20 60°C 60 sek 30 0,25 U 10 pmol<br />
Exon 21 60°C 60 sek 30 0,25 U 10 pmol<br />
Exon 22 60°C 60 sek 30 0,50 U 10 pmol<br />
Exon 23 60°C 60 sek 30 0,50 U 10 pmol<br />
Exon 24 55°C 30 sek 35 0,25 U 5 pmol<br />
Exon 25 60°C 60 sek 30 0,50 U 10 pmol<br />
Exon 26 60°C 60 sek 30 0,50 U 10 pmol
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