Ataxie mit okulomotorischer Apraxie Typ 2: Charakterisierung des ...

Ergebnisse 32
Patient P9
Patient P9 ist heterozygot für die gleiche Nonsense-Mutation (c.4816C>T, p.R1606X), die
auch schon bei Patient P8 gefunden wurde. Durch die Sequenzierung konnte keine weitere
Mutation detektiert werden.
Real-Time-PCR P9
Die nachfolgend durchgeführte Real-Time-PCR an genomischer DNA deutete jedoch auf
eine heterozygote Deletion der Exons 12 bis 14 hin.
Bruchpunktbestimmung P9
Mit einer Long-range-PCR gelang es nicht, diesen Bereich zu amplifizieren. Daher wurden
die Introns 11 und 14 mittels Primer-Walking näher untersucht. Hierfür wurden nach und
nach 11 Primerpaare generiert, mit deren Hilfe die Deletion immer näher eingegrenzt
werden konnte. So konnte bei Patient P9 letztendlich nach einer aufwendigen Analyse ein
bruchpunktüberspannendes PCR-Produkt hergestellt werden (Tabelle 7, S. 12). Die
Sequenzierung dieses PCR-Produktes führte zu der Detektion einer ~6,1 kb großen
Deletion zwischen den Introns 11 und 14 (c.5374+9369_5950-254del6107bp). Eine
Sequenzanalyse dieser Intronbereiche mit dem RepeatMasker-Programm zeigte, dass sich
beide Bruchstellen in Alu-Elementen (AluSq bzw. AluSz) befinden. In Abb. 8a ist ein
Sequenzvergleich des Bruchpunktbereiches bei Patient P9 und der 5’- und 3’-Wildtyp-
Regionen um die Bruchpunkte gezeigt. Die Regionen um die beiden Bruchstellen weisen
eine große Homologie auf, ein Bereich von 28 Basen ist sogar identisch.
RNA-Analysen P9
An der RNA-Probe von Patient P9 wurde eine RT-PCR durchgeführt und die Produkte
anschließend auf ein 0,8%iges Agarosegel aufgetragen. Hierfür wurden Primer genutzt, die
in Exon 11 und 16 lokalisiert sind und somit die Deletion umgeben (Tabelle 6, S. 11). Das
RT-PCR-Produkt ließ sich auf dem Agarosegel in drei Banden mit einer Größe von 912
bp, 337 bp und 180 bp auftrennen (Fragment 4-6, Abb. 7a, S. 31). Die drei Banden wurden
aus dem Gel eluiert, kloniert und anschließend sequenziert. Das 912 bp große Fragment
entspricht dem Wildtyp-Transkript, welches die Exons 11 bis 16 enthält. Die
Sequenzierung des 337 bp-Transkripts zeigte, dass hier die Exons 12 bis 14 fehlen
(Fragment 5, Abb. 7b, S. 31). Dies führt auf Protein-Ebene zu einem Leserasterverschub an
der Aminosäure-Position 1792 und somit zu einer vorzeitigen Termination des Proteins