Ataxie mit okulomotorischer Apraxie Typ 2: Charakterisierung des ...

Diskussion 69
Projekten die ATPase- und Helikaseaktivität des Senataxins nachzuweisen und den
pathogenen Effekt der identifizierten Mutationen untersuchen zu können.
Zu Beginn wurde mittels PCR an einem humanen cDNA-Klon (DKFZp686E18109) ein
Fragment (SETX1) amplifiziert, das die postulierte Helikasedomäne (Aminosäure 1931 bis
2456) enthält. Daraufhin wurden das Fragment sowie ein 6xHis-Tag in den Vektor pGEX-
4T-2 kloniert und verschiedene Expressionsbedingungen, wie Expressionsdauer, IPTG-
Konzentration und verschiedene Expressionsstämme, ausgetestet. Diese Vorversuche
hatten zur Folge, dass die Proteinexpression des pGEX-SETX2-6xHis-Fusionsproteins in
den E. coli BL21(DE3)-RIL-Zellen mit einer IPTG-Konzentration von 0,25 mM über
Nacht durchgeführt wurde. Die Aufreinigung des Fusionsproteins erfolgte über GST-
Sepharose. Ein Western Blot zeigte jedoch, dass die Proteinausbeute sehr gering ist. Eine
Aufgabe für die Zukunft ist also in erster Linie größere Mengen an Protein herzustellen,
indem entweder die Proteinexpression und Aufreinigung weiter optimiert werden, oder die
Anzucht der Zellen in einem viel größeren Maßstab durchgeführt wird. Versuche zur
alternativ möglichen His-Tag-Aufreinigung und zur Isolierung des rekombinanten Proteins
aus den Einschlusskörperchen sind ebenfalls bereits in Arbeit.
In weiteren Experimenten soll die funktionelle Expression des rekombinanten
Senataxinfragments in E. coli durch einen ATPase- und Helikasetest bestätigt werden.
Untersuchungen zur Expression und Funktion von Proteinen sind notwendig, um zur
Aufklärung der zellulären Mechanismen beizutragen, die zu den krankhaften
Veränderungen im Nervensystem führen, um das Krankheitsgeschehen zu begreifen und
dadurch Therapieansätze entwickeln zu können.