Analysen des hämatopoetischen Chimärismus - TOBIAS-lib ...

3 Methoden
3.1 Untersuchungsmaterial
Als Ausgangsmaterial für die Chimärismusanalysen sind 1 bis 3 Tage alte, mit
EDTA versetzte Knochenmarksproben verwendet worden. Die Untersuchungen im
Knochenmark sind nach 30, 60, 100, und 180 Tagen nach SZT sowie nach 9 Mo-
naten und einem Jahr durchgeführt worden. Die Analysen sind im Ergebnisteil
zusammen mit den Routineuntersuchungen im Vollblut dargestellt. Letztere sind bis
100 Tage nach SZT wöchentlich und dann monatlich untersucht worden. In der ALL
ist der Chimärismus in der CD3-, CD10-, CD19- und CD34-Subpopulationen, in der
AML in der CD33- und CD34- Subpopulationen bestimmt worden.
3.2 Zusammenfassende Übersicht
Im ersten Schritt der Zellaufbereitung wird zunächst eine Separation der mono-
nuklearen Zellen aus dem Gesamtknochenmark über die Dichtezentrifugation
erreicht. Die Selektion der Subpopulationen wird mit Hilfe des „Magnet-aktivierten
Cell-sortings“ (MACS) durchgeführt. Für die Chimärismusanalysen wird die fluores-
zenzmarkierte STR-PCR eingesetzt. Hier werden die DNA-Fragmente der gewon-
nenen Proben vervielfältigt sowie farblich markiert. Im Anschluss werden letztere
mit Hilfe der Kapillarelektrophorese der Länge nach voneinander aufgetrennt und in
ihrer Quantität (in %) beurteilt.
3.3 Isolierung der mononuklearen Zellen aus dem Knochenmark
Die Trennung der mononuklearen Zellen aus dem ursprünglichen Knochenmarks-
Punktat erfolgt über die Dichtezentrifugation. Über einen in einem Röhrchen auf-
gebauten Dichte-Gradienten können durch Zentrifugation Zellen bestimmter Dichte
separiert werden[2].
Dazu werden 3 ml Ficoll-Isopaque-Lösung in ein Lecosep-Röhrchen (10 ml) ge-
geben und zentrifugiert (1000 g, 30 sec). In diesem Röhrchen befindet sich an der 3
ml Markierung eine Filterscheibe, die anschließend ein einfaches Aufbringen von 3
bis 6 ml EDTA-Knochenmark ermöglicht und ein Vermischen der beiden Flüssig-
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