Analysen des hämatopoetischen Chimärismus - TOBIAS-lib ...

Hierzu werden von den in PBS gelösten Mononuklearen Zellen 80 µl in ein
Leucosep Röhrchen gegeben und mit 20 µl des gewünschten CD-Antikörpers
versetzt. Das steril abgeschlossene Suspensat wird bei 4 °C unter gelegentlichen
Schütteln 15 min inkubiert. Nach der Zugabe von 400 µl PBS erfolgt die
Zellauftrennung im Auto-MACS-Seperator mit dem Posseld-Programm. Die positiv
eluierten Zellen werden in einem 0,5 ml Eppendorfhütchen aufgefangen und
abzentrifugiert (1000 g, 5 min).
3.5.2.2 Isolation der CD10-Subpopulation
Die Separation der CD10-Subpopulation erfolgt über eine indirekte Bindung des
Antikörpers. Die Zellen werden hierfür zunächst mit einem Flourochrom-conjugier-
ten Antikörper markiert, der erst die indirekte Bindung eines Anti-Micro Bead
ermöglicht.
Zu den 80 µl Zellsuspensat werden 10 µl CD10-PE gegeben und bei Raumtem-
peratur für 5 min inkubiert. Anschließend werden die Zellen abzentrifugiert (300 g,
10 min) und der Überstand abgenommen. Die Zellen werden erneut in der
Ursprungsmenge (80 µl) PBS suspensiert. Alle weiteren Arbeitsschritte entspre-
chen denen der direkten Markierung. Als ferromagnetische Antikörper ist hier der
20 µl Anti-PE zu verwenden.
3.5.2.3 Isolation der CD34-Subpopulation
Die Separation der CD34-Subpopulation erfolgt ebenfalls über eine direkte Bindung
des Antikörpers an der Zelle; jedoch reagiert letzterer mit einem weiteren
Oberflächen Protein, dem FC-Fragment. Um eine unspezifische Bindung der
CD34-Antikörper und einer Verunreinigung der Subpopulation entgegenzuwirken,
ist das FC-Fragment vorher abzuschirmen.
Zu den 80 µl Zellsuspensat werden 20 µl FC-Block-Agens pipettiert und inkubiert
(20 °C, 5 min). Anschließend werden 20 µl CD34-Anti körper zu dem Suspensat hin-
zugefügt und erneut inkubiert (4 °C, 30 min). Nach der folgenden Zentrifugation
(300 g, 10 min) wird der Überstand abgenommen und die Zellen in 500 µl PBS
resuspensiert.
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