Analysen des hämatopoetischen Chimärismus - TOBIAS-lib ...

3.4.1 DNA – Isolation
Für die Isolation werden vorerst die gefrorenen Proben oder die sog. Zellpellets auf
Raumtemperatur erwärmt. Von diesen werden 200 µl in ein Eppendorfgefäß
gegeben. Ist das Volumen geringer als 200 µl, wird die restliche Menge mit PBS
ergänzt. Anschließend werden dazu 25 µl Potease K und 200 µl Puffer AL pipettiert.
Die Protease K darf auf keinen Fall direkt in den Puffer AL gegeben werden. Im
Anschluss wird das Gemisch sofort so lange gevortext, bis alle Bestandteile gleich-
mäßig gelöst sind, und dann zur Inkubation für 10 min in das 70 °C vorgewärmte
Wasserbad gestellt, um die Zelllyse zu beschleunigen. Danach werden zu jeder
Probe 210 µl Ethanol pipettiert, die Mischung gevortext und alles vorsichtig in eine
QIAamp-Spinsäule übertragen. Die Probe wird bei 8000 UPM für 1 min zentri-
fugiert. Diese Säule enthält eine Siliconmembran, auf der die aufgebrachte DNA
zurückgehalten und auf diese Weise von den anderen durch die Membran hin-
durchtretenden, verunreinigenden Bestandteile der Zelle getrennt wird. Es folgen
zwei Waschschritte mit 500 µl PBS, wobei der erste bei 8000 UPM für 1 min und
der zweite bei 13000 UPM für 2 min zu zentrifugieren ist. Zum Eluieren der DNA
wird die Säule auf ein neues Eppendorfhütchen überführt. In die Säule wird 50 µl
AE Puffer gegeben und für 1 min inkubiert und dann zentrifugiert (8000 UPM, 1
min). Das Zentrifugat wird für 1 min auf 70 °C erhitzt, erneut auf die Säulen
gegeben und wiederum abzentrifugiert. Die Säule ist zu verwerfen. Für die Konzen-
trationsbestimmung werden 5 µl entnommen, in ein Eppendorfgefäß überführt und
mit 95 µl Aqua dest. verdünnt. Die Probe wird bei –20 °C eingefroren.
Wiederholtes Auftauen und Einfrieren hat keinen negativen Effekt auf die PCR-
Analyse [12]. Ein Aliquotieren der DNA ist deshalb nicht erforderlich.
3.4.2 Spektrophotometrische Bestimmung der DNA-Quantität
Für die spektrophotometrische Bestimmung der DNA-Quantität werden 5 µl DNA
Lösung auf 95 µl ddH2O in eine 100 µl Glas-Cuvette pipettiert. Die optische Dichte
(OD) des Suspensats wird zwischen 260 nm und 280 nm am Genequant-Spektro-
photometer ermittelt.
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