Analysen des hämatopoetischen Chimärismus - TOBIAS-lib ...

Die optimalen Markierungsverhältnisse für die verwendeten Micro Beads sind nach
den Angaben des Herstellers bei einer Zellzahl von 1 x 10 7 gegeben. Der Median
der verwendeten Zellen hat in dieser Studie bei 0,25 x 10 7 gelegen. Um die
niedrigen Mengen auszugleichen, wird die Isolation bei allen Subpopulationen am
Auto-Macs-Seperator mit dem posseld-Programm durchgeführt, bei dem das Sus-
pensat zwei magnetische Säulen durchläuft. Hiermit wird sichergestellt, dass alle
markierten Zellen in dem aufgebauten Streufeld zurückgehalten werden. Dieses
Programm wird für die Aufreinigung von Subpopulation mit sehr niedrigen Zell-
zahlen empfohlen [2;3].
3.5.2.4 Weiterverarbeitung der eluierten Zellen
Die positiv eluierten Zellen werden in einem 0,5 ml Eppendorfhütchen aufgefangen
und abzentrifugiert (1000 g, 5 min). Der Überstand ist abzupipettieren und zu ver-
werfen. Auf das Zellpellet werden 20 µl in PBS verdünnter PCR-Puffer (1:10) gege-
ben und anschließend mit 30 µl Mineralöl ergänzt. Beim anschließenden Erhitzen
auf 95 °C (15 min) verhindert das Öl ein Verdunsten der Probe. Durch die hohen
Temperaturen kommt es zur Zerstörung der Zellmembranen und zur Freisetzung
der denaturierten DNA. Durch ein kurzes anzentrifugieren (8000 g) wird ein Abset-
zen der Zellbestandteile auf den Gefäßboden erreicht. Anschließend ist das Pro-
dukt bis zur Weiterverarbeitung bei –20°C aufzubewa hren.
3.6 Floureszenz-markierte-STR-PCR
3.6.1 Prinzip der Polymerase-Kettenreaktion
Die PCR (Polymerase-Kettenreaktion) ist eine einfache Methode der DNA-Ampli-
fizierung, welche durch mehrfache Wiederholungen eines Reaktionszyklus erreicht
wird. Am Anfang dieses Zyklus steht die Denaturierung der DNA bei 95 °C, d.h. die
Entspirilisation und das Auseinanderbrechen der Doppelhelix. Beim Abkühlen auf
ca. 60 °C kommt es zum Anneling, d.h. zur Bindung d es Primers an die komple-
mentären DNA-Sequenzen. Letzterer ermöglicht die Anlagerung der Taq-Poly-
merase. Diese katalysiert die Synthese komplementärer Oligonukleotide und bildet
aus der DNA in der sog. Extensionsphase wieder eine Doppelhelix. Bei der mehr-
fachen Wiederholungen dieses Zyklus ergibt sich eine exponentielle Zunahme der
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