Analysen des hämatopoetischen Chimärismus - TOBIAS-lib ...

Moleküle. 20 Zyklen resultieren in einer 10 6 -fachen Amplifikation eines doppelsträn-
gigen Moleküls. Durch die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Primern sind die
neu synthetisierten Oligonukleotide farblich markiert [2;7].
3.6.2 Short-tandem-Repeats
Ursprünglich ist die STR-PCR in der forensischen Medizin angewandt worden. Sie
dient dort der Bestimmung des genomischen Fingerabdruckes. Letzterer basiert auf
einem System hoch polymorpher, sich wiederholender, nicht codierender Sequen-
zen von 2 - 7 Basenpaaren (Tandems). Die Unterscheidung der Individuen ergibt
sich aus der unterschiedlichen Anzahl der Wiederholungen dieser Sequenzen und
den hieraus resultierenden Längenvarianten. Insgesamt erreichen die STRs
Längen von 80 bis 300 Basenpaaren [58;63;93;94].
3.6.3 Primerauswahl
Für die Differenzierung der Spender- von den Empfängerzellen stehen für die hier
dargestellten Untersuchungen 12 Primer zur Verfügung (Tab. 1). Ein Primer ist nur
dann für die Chimärismusanalysen geeignet, wenn zwischen den synthetisierten
DNA-Produkten ein Längenunterschied von mindestens 4 Basenpaaren besteht.
Besitzen der Spender und der Empfänger für einen Primer dasselbe Allel, ist dieser
folglich für eine Unterscheidung nicht geeignet. Für die Analysen nach SZT wird der
informativste Primer ausgewählt.
3.6.4 PCR-Probenansatz
Als Richtlinie für die PCR-Amplifikation wird das Quiagen-Taq-DNA-Polymerase-
Protokoll herangezogen. Alle Arbeiten werden auf Eis durchgeführt. Die Primer und
die Taq-Polymerase sind sehr licht- und wärmeempfindlich, so dass der Zeitraum
außerhalb des Kühlschrankes so kurz wie möglich gehalten werden sollte. Die
Primer werden aus diesem Grund aliquotiert.
Für den PCR-Ansatz wird für jede Probe ein Master Mix von 9,5 µl vorbereitet.
Der Master Mix-Ansatz wird in einem Eppendorf-Gefäß vorbereitet und besteht aus
den nachfolgend aufgelisteten Reagenzien. Die Angaben sind mit der Anzahl der
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