Analysen des hämatopoetischen Chimärismus - TOBIAS-lib ...

Einer OD260 von 1 entsprechen 0,05 µg / µl doppelsträngiger DNA. Abschließend
wird die Reinheit der DNA über dem Quotienten von OD260 / OD280 bestimmt.
Einer hohen Reinheit entspricht ein Wert von 1,8.
3.5 Isolierung der Subpopulationen mit Hilfe des „MACS“
3.5.1 Prinzip der „Magnet-aktivierten-Zellsortierung“
Die Isolierung der verschiedenen Subpopulationen ist mit Hilfe des MACS (Magnet-
activated Cell-Sorter) erfolgt. Hierzu werden die zu isolierenden Lymphozyten über
ihre CD-Oberflächenantigene mit ferromagnetischen Antikörpern (AK, Micro Beads)
markiert. Für die Separation durchläuft die zu bearbeitende Zellsuspension eine in
einem Magneten platzierte Trennsäule. Der Kern dieser Säule besteht aus plastik-
ummantelten kleinen Eisenkugeln, zwischen denen sich im magnetischen Feld ein
Streufluss aufbaut, der die markierten Zellen zurückhält. Nicht markierte Zellen
werden aus der Säule ausgewaschen. Durch ein anschließendes Abschalten des
Magneten können die positiv markierten Zellen aus der Säule selektiv eluiert
werden [2].
3.5.2 Isolation der Subpopulationen
Die Markierung der Zellen erfolgt entweder direkt über die CD-Oberflächenantige
oder indirekt über einen dazwischen geschalteten Antikörper. Die verwendeten
Micro Beads werden in Dunkelheit bei 4 °C im Kühlsc hrank gelagert. Verklumpte
Proben werden nicht isoliert, da die Reinheit der Subpopulation nicht mehr gewähr-
leistet werden kann.
Je nach Diagnose werden zu dem gewonnenen Zellpellet entweder 160 µl PBS bei
der AML und MDS oder 320 µl PBS bei der ALL pipettiert. Für jede Subpopulation
stehen schließlich 80 µl Zellsuspensat für die Isolierung der einzelnen Subpopu-
lationen zur Verfügung. Alle folgenden Arbeitsschritte werden auf Eis durchgeführt.
3.5.2.1 Isolation der CD3-, CD19- und CD33-Subpopulation
Die Separation der CD3-, CD19- und CD33-Subpopulationen erfolgt über eine
direkte Markierung der Zellen mit Antikörpern.
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