Analysen des hämatopoetischen Chimärismus - TOBIAS-lib ...

keiten verhindert. Während der erneuten Zentrifugation (15 min, 800 g, Bremse 5)
erfolgt die Isolierung der mononukleären Zellen in der sog. Interphase des erzeug-
ten Gradienten. Aufgrund Ihrer geringen Dichte werden diese Zellen an der Grenz-
fläche des Gradienten festgehalten und als heller Ring sichtbar. Im folgenden
Waschschritt wird der helle Ring mit der Pasteurpipette vorsichtig abgetragen, in ein
frisches 15 ml Flaconröhrchen gegeben und mit 10 ml PBS (Phosphat-gepufferte-
Salzlösung) resuspensiert. Der Rest ist zu verwerfen. Nach einer weiteren Zentri-
fugation (12 min, 450 g, Bremse 5), wird der Überstand abpipettiert und das Zell-
pellet in 1 ml PBS gelöst. Für die spätere Zellzählung (am Cobas-Micros) werden
50 µl abgenommen und zu 450 µl PBS in ein Eppendorf-Gefäß gegeben. Die
restlichen Zellen werden für den 2. Waschschritt wieder mit 10 ml PBS versehen,
gemischt und abzentrifugiert (12 min, 350 g, Bremse 5). Der Überstand ist abzu-
pipettieren.
Alle folgenden Arbeitsschritte werden auf Eis durchgeführt. Werden die Zellen erst
am folgenden Tag weiterverarbeitet, müssen sie über Nacht in 6 ml Nährlösung bei
4°C im Kühlschrank gelagert werden.
3.4 DNA-Isolation aus den Nativproben von Spender und Patient
Die Chimärismusanalysen der Subpopulationen werden im Vergleich mit den Nativ-
proben von Donor und Rezipient durchguführt. Die Quantität dieser Nativproben
wird spektrophotometrisch bestimmt. Die DNA-Isolierung wird nach dem QIAamp-
Blood-Kit-Verfahren entsprechend den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt.
Die aufgereinigte DNA ist anschließend frei von Proteinen, Nukleasen und anderen
Kontaminationen.
Die dazu benötigte Protease K wird im Kühlschrank aufbewahrt. Die Reagenzien
Puffer AL, Reagenz AL1, Puffer AL2, Puffer AE und Puffer AW werden unter Licht-
abschluss bei Raumtemperatur aufbewahrt.
Vor jeder Isolierung ist ein Wasserbad und der Puffer AE auf 70 °C vorzuwärmen.
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