Analysen des hämatopoetischen Chimärismus - TOBIAS-lib ...

3.7 Die Kapillarelektrophorese
3.7.1 Prinzip der Elektrophorese und die Verarbeitung der Daten
Das Funktionsprinzip der Elektrophorese beruht auf der unterschiedlichen Diffu-
sionsgeschwindigkeit von Oligonukleotiden in einem elektrischen Feld. Getrieben
durch die eigene Ladung werden die DNA-Fragmente in Gelen der Größe bzw.
Länge nach aufgetrennt [2;7]
In dieser Studie ist die Auftrennung der DNA-Fragmente am ABI PRISM 310-
Genetic-Analyser-System erfolgt. Hier durchlaufen die fluoreszenzmarkierten-DNA-
Produkte eine Kapillare, in der nach einer festgelegten Strecke die Emissionen der
Farbstoffe gemessen werden. Das multi-color-detektion-System des ABI PRISM
310 ermöglicht es, verschiedene Fluoreszenz-Farbstoffe simultan zu detektieren.
Somit können drei unterschiedlich markierte DNA-Fragmente in einer Spur ana-
lysiert werden.
Die erhobenen Daten werden mit Hilfe der GeneScan-Analysis-Software ausge-
wertet. Dieses Programm identifiziert die DNA-Banden und vergleicht sie mit einem
mitlaufenden Standard (ROX 500), der eine Beurteilung der Länge und der DNA-
Menge der Probe ermöglicht.
Mit Hilfe der GenoTyper-Software werden die Ergebnisse in einem Kurven-
diagramm nach Fragmentlänge und Signalintensität dargestellt und die Integrale
der Kurven quantifiziert.
3.7.2 Probenansatz für die Kapillarelekrophorese
Die PCR-Produkte werden mit 40 µl H2O verdünnt.
Für jeweils drei Proben wird ein Hütchen mit 13,7 µl Formamid und 0,3 µl eines
Standards (GeneScan Rox 500) vorbereitet. Da die PCR-Produkte mit drei unter-
schiedlichen Farben (fam, hex, ned) markiert werden, können diese parallel in einer
Spur analysiert werden. Von jedem verdünnten Produkt wird 1 µl in ein Hütchen
pipettiert. Das Suspensat wird vorsichtig kurz geschüttelt und auf eventuelle Luftbla-
sen am Boden des Hütchens kontrolliert. Die Probe wird denaturiert (90 °C, 2 min),
sofort abgekühlt und in das ABI PRISM 310 System zur Analyse überführt.
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