Analysen des hämatopoetischen Chimärismus - TOBIAS-lib ...

zu untersuchenden Proben zu multiplizieren und in der aufgelisteten Reihenfolge in
die Eppendorfhütchen zu pipettieren.
1. 7,0 µl H2O
2. 1,4 µl PCR-Puffer – 10 x PCR-Puffer ( enthält 15 mM MgCl2)
3. 0,8 µl dNTP – 10 nmol / µl / dNTP
4. 0,2 µl Primer (1 + 2) – je 50 pmol / µl
5. 0,1 µl Taq – Polymerase
Für die Analyse der Nativ-DNA von Spender und Empfänger sowie für die zu unter-
suchende Knochenmarksprobe werden 0,5 µl DNA (enthält ca. 100 ng DNA) zu
dem Master Mix in die entsprechend vorbereiteten Hütchen pipettiert. Für die
Analyse der Subpopulationen wird die doppelte Menge verwendet. Anschließend
werden die PCR-Gefäße kurz auf dem Titertek geschüttelt und in die Cycler
gestellt.
3.6.5 Thermocyclerprogramme
Entsprechend der unterschiedlichen Annealing-Temperaturen und Zyklen der
verschiedenen Primer werden die Ansätze wie folgt gecycelt:
Primer NR: 1, 3, 7 5, 14-18, 20, 21 4 17
Initiale Denaturierung
Denaturierungsschritt
Primer-Annealing
Primer-Extension
Cyclenzahl
94° C, 3 min
94° C, 1 min
58° C, 0,45 min
72° C, 1:30 min
35 Cyclen
Tabelle 2: Thermocyclerprogramme
94° C, 3 min
94° C, 1 min
62° C, 0,45 min
72° C, 1:30 min
35 Cyclen
24
94° C, 3 min
94° C, 1 min
65°C, 0,45 min
72° C,1:30 min
35 Cyclen
94° C, 3 min
94° C, 1 min
64° C, 0,45 min
72° C, 1:30 min
35 Cyclen
Nach dem Abschluss der Programme werden die Produkte bis zur Weiterver-
arbeitung bei 4 °C gelagert.