POSTĘPY CHROMATOGRAFII - Zakład Chemii Analitycznej

ROZDZIELANIE PEPTYDÓW I BIAŁEKW UKŁADACH JONOWYMIENNYCHW chromatografii jonowymiennej jest zasadą, że substancje posiadająceładunek elektryczny są rozdzielane na kolumnie, która ma na powierzchnisorpcyjnej odwrotny ładunek elektryczny do substancji rozdzielanych.Grupy jonowe wymieniacza jonowego są kowalencyjnie wiązanez powierzchnią sorbentu i ich ładunki elektryczne są kompensowane przezjony obecne w eluencie (buforze). Po wprowadzeniu próbki do kolumny centrajonowe słabo związane z eluentem, ulegają wymianie na jony substancjirozdzielanych. Wykorzystuje się okoliczność, że peptydy i białka mogą posiadaćzarówno ładunek dodatni, jak ujemny w zależności od pH buforu.Podczas stosowania buforów o charakterze kwaśnym, peptydy występująw postaci kationów (zahamowanie dysocjacji grup karboksylowych i sprotonowaniegrup aminowych oraz najbardziej polarnych grup NH 2 w połączeniachpeptydowych). W przypadku stosowania buforów zasadowych, peptydyi białka występują w postaci anionów (sprotonowane grupy aminowe sązasadami wiążącymi grupy hydroksylowe, a grupy karboksylowe są zdysocjowane,albo tworzą pary jonowe ze sprotonowanymi kationami zasadowychdodatków). Netto dodatni lub ujemny elektryczny ładunek peptydu /białka umożliwia jego związanie z odpowiednimi centrami fazy stacjonarnej.Z zastosowaniem gradientu soli lub niekiedy, dodatkowo zmiany pH buforu,powoduje się stopniową elucję substancji związanych z powierzchnią wymieniaczajonowego.Na retencję peptydów i białek w warunkach chromatografii jonowymiennejwpływają głównie cztery czynniki: siła jonowa eluentu, jego pH i powierzchniawłaściwa wymieniacza jonowego (gęstość obsadzenia molekułamiwymieniacza jonowego), a także rozkład wielkości porów adsorbentu.Zwiększając siłę jonową eluentu obniżamy retencję peptydów i białekw przypadku obu wymieniaczy, kationowych i anionowych. Zwiększając pHbuforu obniżamy retencję na kationitach, a podwyższamy na anionitachi odwrotnie - zmniejszając pH buforu podwyższamy retencje na kationitach,a obniżamy na anionitach. Poszerzenie zakresu średnic porów w stosunkudo hydrodynamicznej średnicy cząsteczek rozdzielanych białek przyczyniasię do podwyższenia retencji w przypadku stosowania kationitów [19]i prawdopodobnie także w przypadku anionitów.Wzrost stopnia obsadzenia powierzchni jonitu grupami jonowymiennymiwpływa, oczywiście, na wzrost retencji w konkretnych warunkach rozdzielania.Jednak, do rozdzielania peptydów i białek w warunkach chromatografiielucyjnej nie są zalecane wymieniacze jonowe o bardzo wysokimstopniu nasycenia powierzchni sorpcyjnej grupami jonowymiennymi, w przeciwieństwiedo chromatografii jonowymiennej w warunkach selektywnejsorpcji – desorpcji jonowymiennej, gdy pojemność jonowa wymieniacza jonowegopowinna być możliwie jak najwyższa.W zależności od właściwości rozdzielanych peptydów / białek, dobierasię odpowiedni wymieniacz jonowy. Stosuje się wiele rodzajów kolumn jo-123