POSTĘPY CHROMATOGRAFII - Zakład Chemii Analitycznej

hydrofobowe są silniejsze, gdy pH buforu znajduje się blisko punktu izoelektrycznegobiałka [64]. Główną zaletą chromatografii oddziaływań hydrofobowych(HIC) do rozdzielania białek i peptydów jest zachowanie aktywnościbiologicznej cząsteczek przez co rozdzielanie jest mniej destrukcyjne niżw przypadku układu faz odwróconych (RP-HPLC). Jednakże, nie wszystkiebiałka obecne w badanej próbce zawsze zostają rozdzielone, zatem niemożna metody HIC traktować jako „panaceum separacyjne”. Należy zawszeją brać pod uwagę, gdy konieczne jest rozdzielanie białek i peptydów o wysokichmasach molekularnych (powyżej 50 tys. Daltonów).CHROMATOGRAFIA WIELOWYMIAROWAObecnie, identyfikacja i oznaczanie białek w złożonych mieszaninachbiałkowych jak w przypadku analizy proteomu komórkowego jest częstoosiągana poprzez połączenie różnych metod separacyjnych takich jak SEC,IEC, RP-HLC lub innych technik chromatograficznych [65, 66]. Wykorzystaniejednego mechanizmu separacji jest bardzo często niewystarczające.Sprawność separacji może zostać polepszona poprzez połączenie różnychrodzajów kolumn chromatograficznych bądź poprzez wykorzystanie różnychkonfiguracji analitycznych. Najczęściej wielowymiarowa separacja obejmujedwie bądź więcej techniki rozdzielania podczas jednej analizy.Podstawowe wymagania zostały początkowo zasugerowane w pracyGiddings’a na temat wielowymiarowej separacji białek [67]. Dla dwuwymiarowejseparacji można zastosować chromatografię jonowymienną (zazwyczajkationowymienną) [68, 69], SEC lub chromatografię powinowactwa [70,71] w połączeniu z RP-HPLC. Opiteck i inni [72,73] połączyli chromatografięz silnym wymieniaczem kationowym lub SEC z RP-HPLC by frakcjonowaćcałkowite lizaty bakterii Escherichia coli. W przybliżeniu wyizolowano 450białek. Identyfikacja 14 z nich była przeprowadzona przy użyciu spektrometriimas (MS) i sekwencjonowania Edmana.PROTEOMIKAProteomika jest nowo powstającą dziedziną naukową. Jej celem sąbadania w dużej skali nad składem białek, ich charakterystyką (na przykładmodyfikacje posttranslacyjne) i oddziaływania pomiędzy białkami (równieżz innymi biomolekułami takimi jak lipidy bądź kwasy nukleinowe) w żywychkomórkach bądź całych organizmach. W proteomice podczas badań złożonamieszanina białkowa musi zostać rozdzielona na pojedyncze białka (lubokreślone grupy białek) zanim zostanie strawiona do formy peptydów w celuumożliwienia identyfikacji MS (ryc. 8).W badaniach w proteomice często stosowana jest dwuwymiarowaelektroforeza żelowa jako wstępna technika do frakcjonowania, jak równieżdo określania masy molekularnej i punktu izoelektrycznego rozdzielonych131