POSTĘPY CHROMATOGRAFII - Zakład Chemii Analitycznej

CHROMATOGRAFIA ŻELOWAChromatografia wykluczania (SEC), zwana również chromatografiążelową (GPC), znajduje ogromne zastosowanie w separacji peptydówi białek oraz do odsalania. Bazuje na wykorzystaniu różnicy wielkościi kształtu, a w konsekwencji różnic w wartości efektywnego promienia hydrodynamicznegorozdzielanych substancji. Molekuły o różnych rozmiarachw różnym stopniu penetrują pory sorbentu. Małe cząsteczki są w większymstopniu zatrzymywane w kolumnie, a duże są szybciej eluowane. SEC mazastosowanie do rozdzielania peptydów i białek o masie molowej w zakresie2 do 1000 kDa. Technika ta może być stosowana do wyznaczania masy molowejbiałek. Jednak nie tylko masa cząsteczkowa, ale również kształt cząsteczkibiałka oraz oddziaływania sorpcyjne, trudne do całkowitego wyeliminowaniamają wpływ na retencję, dlatego też konieczna jest starannakalibracja przy użyciu odpowiednich białek kalibracyjnych.Dużego znaczenia nabierają, ostatnio, złoża SEC wykonane w technologiiruchomych ligandów, „tentacle” (podobnie jak w przypadku złóż jonowymiennych).Rozmiary porów i ich rozkład gwarantują rozdzielenie białekzgodnie z wielkością i kształtem cząsteczek. „Dynamiczne” ligandy uniemożliwiająmałym cząsteczkom wniknięcie wewnątrz porów, a większe molekułymają utrudnioną głębszą penetrację [57].SEC jest szczególnie użyteczna jako początkowy etap frakcjonowania,do izolacji dużych ilości zanieczyszczeń, lub jako końcowy etap rozdzielaniaoczyszczonych białek, tzw. „polishing step”.Należy też zwrócić uwagę na szczególną przydatność chromatografiiżelowej do odsalania peptydów i białek. Do tego celu stosuje się często, ciąglejeszcze, tzw. miękkie sita molekularne. Coraz większe znaczenie mają„twarde” wypełnienia kolumn w tych zastosowaniach, takie jak DIOL [58],a także szkła porowate o zdezaktywowanej powierzchni (rys. 6 – przykładanalizy mieszaniny białek z wykorzystaniem GPC-DIOL).128