Aplicaciones de la Biotecnología en Seguridad Alimentaria

BIOTECNOLOGÍA Y SEGURIDAD ALIMENTARIAproporciona carga neta negativa, de modo quela separación se realiza en función del tamaño.• Transferencia de las proteínas a una membranade nitrocelulosa.• Incubación de la membrana con proteínasinespecíficas para bloquear los sitios de unión deanticuerpos a la membrana.• Adición de un anticuerpo primario contra lasproteínas que se quieren detectar.• Adición de un anticuerpo secundario conjugado conuna enzima, que reconoce al anticuerpo primario.• Revelado.4.4. Reacción en Cadenade la Polimerasa (PCR)La reacción en cadena de la polimerasa (PCR ensus siglas en inglés) es un método de análisisrápido y sencillo que permite la detección yamplificación de fragmentos específicos de ADN.La polimerasa es una enzima cuya actividad es lasíntesis de una cadena de ADN complementaria auna cadena de ADN sencilla. Para ello necesita lapresencia de pequeñas secuencias de ADNdenominadas cebadores que deben sercomplementarias de los extremos de la secuenciaque se desea ampliar. La PCR consta de tres pasosque se repiten un número determinado de ciclos:4.3. Southern BlotEs una técnica de hibridación que se utiliza para ladetección de secuencias de ADN concretas dentrode una mezcla compleja. Consiste en la separaciónde fragmentos de ADN en función del tamañomediante una electroforesis en geles de agarosa,su transferencia a membranas de nitrocelulosa onylon y posterior incubación con sondas de ADNcomplementarias a las regiones que se deseadetectar. Estas sondas en caso de que existanfragmentos complementarios hibridarán con ellospudiéndose detectar marcaje. Las etapas de lasque consta esta técnica son:• Fragmentación del ADN problema medianteendonucleasas de restricción.• Electroforesis en condiciones desnaturalizantescon urea o formaldehído para obtener ADN decadena sencilla.• Transferencia a una membrana de nylon onitrocelulosa. Una vez las bandas se hantransferido a la membrana es necesario fijarlasde manera irreversible mediante tratamiento a80-85 ºC en el caso de las membranas denitrocelulosa o con luz ultravioleta en el caso delas membranas de nylon.• Prehibridación de la membrana con ADNheterólogo para bloquear los sitios de unión quehan quedado libres y evitar uniones inespecíficasde las sondas.• Separación del ADN para que se encuentre enforma de cadena sencilla.• Unión de los cebadores al ADN de cadena sencilla.• Síntesis de la cadena complementaria de ADN apartir de los cebadores.La repetición de estos ciclos hace que la cantidaddel fragmento de ADN que se está amplificandoaumente de manera exponencial, de modo queaunque se parta de una cantidad muy pequeña alfinal de un número determinado de ciclos seobtendrá una cantidad muy importante.El diseño de los cebadores es muy importante y suespecificidad dependerá del tipo de amplificaciónque se desee hacer, pudiendo utilizarse cebadoresespecíficos, semiespecíficos o arbitrarios.Pueden realizarse análisis por PCR de tipocualitativo o cuantitativo.4.4.1. Análisis cualitativo de ADNmediante PCREste tipo de análisis permite detectar la presenciao ausencia de determinadas secuencias de ADN enuna muestra, como secuencias características dedeterminados organismos o secuencias indicativasde la presencia de transformación genética, comoen el caso de los OMGs.Análisis de polimorfismos de los fragmentosde restricción (RFLP)• Hibridación con la sonda y revelado del filtropara detectar con qué bandas ha hibridado lasonda.Es un método rápido de identificación basado en laaplicación de enzimas de restricción, que sonenzimas que cortan la molécula de ADN en41