Aplicaciones de la Biotecnología en Seguridad Alimentaria

BIOTECNOLOGÍA Y SEGURIDAD ALIMENTARIAADN competidor. A partir de las cantidadesobtenidas de ambos productos amplificados seestima estadísticamente la proporción real de ADNdiana y de ADN competidor.PCR en tiempo realEste sistema se basa en la medición de lafluorescencia emitida por una sonda específica delADN diana marcada con un fluorocromo noradioactivo, que se añade a la reacción de PCRconvencional y cuya emisión de fluorescenciadepende directamente de la síntesis del nuevoADN. La fluorescencia emitida es recogida a travésde una fibra óptica y leída por un láser.Mediante el registro del contenido de la emisión defluorescencia en cada ciclo se puede monitorizar demanera continua el incremento de los productosamplificados durante la reacción de PCR.Dilución límite de PCRConsiste en la dilución de la muestra de ADN aconcentraciones conocidas hasta llegar al puntolímite de la dilución, que se corresponde con elumbral de amplificación del ADN, permitiendoestablecer una correlación con la cantidad de ADNpresente en la muestra.4.5. SecuenciaciónLa secuenciación del ADN se utiliza habitualmentecomo técnica de comprobación o confirmaciónpositiva de la presencia de un ADN determinado,tras su detección por PCR. Por tanto, el material adetectar suele ser ADN amplificado producto dePCR. Habitualmente es utilizada en estudios deautentificación genética de alimentos, ya sea paraautentificación de especies o detección decomponentes de origen animal o vegetal nodeseados.Los diferentes tipos de secuenciación aplicados sebasan en la técnica desarrollada por Sanger en1974, basada en la utilización de análogos de base(dideoxy) marcados que provocan la finalizaciónde cadena. La principal diferencia entre el métodoenzimático de terminación de cadena y el métodoautomático de secuenciación radica, en primerlugar en el tipo de marcaje. En el métodoautomático en vez de radiactividad se utilizafluorescencia y lo habitual es realizar cuatromezclas de reacción, cada una con nucleótidotrifosfato (dTTP) marcado con un fluorocromodistinto. Este sistema permite automatizar elproceso de manera que es posible leer al mismotiempo los ADNs de nueva síntesis producto de lascuatro mezclas de reacción.La segunda diferencia radica en el sistema dedetección de los fragmentos de ADN. La deteccióndel tipo de fluorescencia correspondiente a cadareacción se lleva a cabo al mismo tiempo que laelectroforesis, de manera que los fragmentos deADN de menor tamaño que ya han sido detectadosse dejan escapar del gel. Este sistema permiteaumentar el número de nucleótidos que se puedendeterminar en cada electroforesis y, porconsiguiente, en cada secuenciación.La secuenciación de cadena simple consiste en lasecuenciación de un fragmento de ADN, medianteuna sola reacción. La secuenciación de cadenasimple proporciona una excelente calidad delectura, que en la mayoría de los casos alcanzauna fiabilidad superior al 98%. El tamaño mediode las lecturas que se obtiene oscila entre las 650-700 pares de bases, y se realiza generalmente apartir de cebadores específicos utilizados durantela PCR. La secuenciación analítica consiste en lasecuenciación completa de una de las cadenas delADN de la muestra. Se recomienda esta modalidadde secuenciación cuando se desea obtener lasecuencia completa de un producto de PCR o deun ADN clonado cuando el tamaño del amplificadoo del inserto sea superior a 1 kilobase.Existen diversas técnicas emergentes desecuenciación de ADN con diversas aplicaciones:secuenciación por hibridación (SBH), visualizacióndirecta por microscopía de fuerza atómica (AFM),secuenciación de molécula sencilla y secuenciaciónde nucleótido simple mediante suspensión envacío. Dentro de ellas destacamos el FINS(Forensically Informative Nucleotide Sequencing).Es una técnica de secuenciación de ADN demuestras biológicas mediante la amplificación conmarcadores fluorescentes de distinto color quepermiten identificar la secuencia de nucleótidos.Se trata de un método indirecto por el que lassecuencias obtenidas se comparan con secuenciaspertenecientes a otras especies, lo que permite elanálisis filogenético de las mismas. Se utiliza parala identificación de especies pesqueras de interéscomercial, normalmente como método deconfirmación tras la utilización de otras técnicascualitativas de PCR.43