slavská (někdy též Veselská) blata na severním okraji Třeboňsképánve, z nichž po dlouhodobé těžbě rašeliny od r. 1956do druhé poloviny 70. let zůstalo zachováno původní rašelinnétěleso s blatkovým porostem jen na fragmentu reprezentujícímjádrovou část dnešní přírodní rezervace Borkovickáblata (PR o celkové rozloze 55 ha). Tato populace reprezentujenejníže položený výskyt blatky v ČR, ve 423 m n. m. Takjako v jiných populacích blatky v Třeboňské pánvi byl i zdev posledních letech zjištěn hromadný úhyn starších stromůblatky vlivem kůrovcové invaze, zde konkrétně posílené <strong>pro</strong>světlenímčásti porostů ve snaze potlačit konkurenční dřeviny.Dlouhodobé narušení vodního režimu blatkových biotopů,genetická eroze vlivem křížení s borovicí lesní (vysazenouobvykle v okolních lesních porostech) a invaze kalamitníchhmyzích škůdců na oslabených zbytcích populace blatky jsoutři hlavní faktory recentního ohrožení přirozených blatkovýchpopulací v nižších polohách.Cílem souhrnného článku je ukázat vypracované metody <strong>pro</strong>identifikaci borovice blatky podle fenotypu a genotypu i <strong>pro</strong>mikro<strong>pro</strong>pagaci tohoto taxonu.MATERIÁL A METODIKAIdentifikace borovice blatky a jejích hybridů podlefenotypuBorovice blatka je součástí agregátu (taxonomické skupiny)Pinus mugo Turra. V rámci tohoto agregátu existuje několikmorfologických znaků, podle kterých jednotlivé zástupcevzájemně neodlišíme, ale lze je s úspěchem použít k odlišeníod nejblíže příbuzného druhu borovice lesní, Pinus sylvestrisL. Protože v PR Borkovická blata, jakož i v celé Třeboňsképánvi a zároveň na většině lokalit blatky (kromě několika nejvýšepoložených v oblasti Šumavy, Slavkovského lesa a Krušnýchhor) se z agregátu P. mugo vyskytuje jen taxon Pinusuncinata subsp. uliginosa (borovice blatka), uvádíme níže (tab.1) pouze přehled vnějších rozdílných morfologických znakůmezi borovicí lesní a blatkou.Kromě uvedených vnějších morfologických znaků existujeněkolik znaků v anatomii jehlic, kterými se oba taxony borovicliší (Businský, Kirschner, 2010). Tyto znaky jsou všakpozorovatelné jen mikroskopem a nejsou vhodné <strong>pro</strong> terénníidentifikaci. V podstatě lze shrnout, že typická (charakteristickyvyvinutá) borovice lesní a blatka jsou vzhledově velmiodlišné entity, takže i identifikace vzájemných hybridů prvnígenerace je podle přechodných znaků s jistými zkušenostmirelativně snadná. Avšak identifikace hybridních jedinců následnýchgenerací nebo některých jedinců z hybridních rojů(resp. populací s dlouho, tj. po mnoho generací, <strong>pro</strong>bíhajícím<strong>pro</strong>cesem mezidruhové hybridizace) může být <strong>pro</strong>blematická.Identifikace borovice blatky a jejích hybridů podlegenotypuEvidentní a stabilní rozdíly v genotypu jedinců z agregátuPinus mugo a jedinců Pinus sylvestris byly nalezeny pouzena chloroplastové DNA (cpDNA) (Wachowiak et al., 2000,2006). Chloroplasty patří mezi tzv. semiautonomní buněčnéorganely, které nesou vlastní genetickou informaci, nezávislouna jaderné DNA. Dědičnost cpDNA při pohlavním rozmnožovánísouvisí se způsobem přenosu semiautonomníchorganel z pohlavních buněk do vznikající zygoty. Jedná setedy o mimojadernou dědičnost. U nahosemenných rostlinse cpDNA přenáší pouze ze samčích pohlavních buněk. Tedyvšechna chloroplastová DNA v potomstvu pochází z pylovéhozrna (dědí se paternálně, samičí chloroplasty vůbec nevstupujído zygoty). Pomocí chloroplastových molekulárněgenetických markerů lze tedy <strong>pro</strong>kázat genetickou introgresivzniklou opylením mateřského stromu Pinus uncinata subsp.uliginosa pylem jedince P. sylvestris.Hybridní potomstvo borovice blatky vzniklé sprášením borovicílesní můžeme <strong>pro</strong>kázat dvěma různými způsoby:1. Analýzou polymorfismu cpDNA v oblasti trnL-trnFPomocí metody PCR-RFLP lze detekovat jednonukleotidovýrestrikční polymorfismus. Wachowiak et al. (2000) popsalodlišná restrikční místa u P. sylvestris a P. mugo. Protokol použitelný<strong>pro</strong> odlišení druhu P. sylvestris a P. uncinata subsp.uliginosa publikovaly Vejsadová a Lukášová (2010). K ampli-Tab. 1 Přehled vnějších morfologických znaků u borovice lesní a borovice blatkyMorfologický znak Borovice blatka Borovice lesníOpylené samičí šištice – konelety(hodnotitelné přibližně od srpna do březnanásledujícího roku):(Polo)vzpřímené na krátkých stopkáchs odklonem od osy výhonu do cca 45°Dolů ohnuté okolo 180° od osy výhonu nadlouhých stopkáchApofýzy dozrálých šišek: Světle až kaštanově hnědé, lesklé Okrové s šedavým nádechem, matnéBarva jehlic, resp. olistění: Tmavě až světle zelená Šedavě světle zelenáBorka:Černavě nebo šedavě hnědá, odlučující sev malých ploškáchNejdříve (na větvích a v horní části kmene)oranžově hnědá, papírově tenká a loupaváv plátech, později (v dolní části kmene)tvořící silná šedá žebraKoruna plně vyvinutého dospěléhostromu:Kuželovitá, s hustou texturou větví všechřádůNepravidelně vejcovitá nebo válcovitá,s řídkými kosterními větvemi a středněhustou texturou koncových větví148
fikaci nekódující oblasti cpDNA použijeme univerzální primery(primer 1: 5‘-CGA AAT CGG TAG ACG CTA CG-3‘a primer 2: 5‘-ATT TGA ACT GGT GAC ACG AG-3‘).PCR směs ve finální koncentraci obsahuje 10 ng celkovéDNA, 2.5mM MgCl2, <strong>100</strong>μM dNTP, 0.2μM každého primeru,0.25 U Taq polymerázy a 1× koncentrovaný reakčnípufr. Teplotní <strong>pro</strong>gram PCR se skládá z počáteční denaturace5 min při 96°C, následuje 35 opakovaných cyklů: 30 s při94°C, 60 s při 53 °C, 90 s při 72 °C, zakončeno 10 min.inkubací při 72 °C. K restrikčnímu štěpení odebereme 10 μlPCR <strong>pro</strong>duktu, inkubujeme přes noc při 37 °C s enzymemDraI. Vzorky pak analyzujeme nanesením směsi na 2% agarosovýgel a elektroforetickým rozdělením v TBE pufru.Enzym nalezne restrikční místo pouze u P. uncinata subsp.uliginosa, u P. sylvestris zanechá úsek neštěpený. Po rozdělenívzorků na horizontálním agarózovém gelu se rozdíly ve velikostifragmentů snadno detekují a identifikujeme odlišnéhaplotypy. Haplotyp P. sylvestris (haplotyp S) zůstává digescínedotčený, na gelu je viditelný jeden amplifikovaný fragmentcpDNA v délce cca 1030 bp (tab. 2). Na<strong>pro</strong>ti tomu haplotypP. uncinata subsp. uliginosa (haplotyp M) vykazuje na gelurozštěpenou cpDNA, viditelné jsou dva <strong>pro</strong>užky o velikostechcca 800 bp a 250 bp.Tab. 2 Hodnocení druhové příslušnosti (+ fragment přítomen,– fragment nepřítomen)DruhFragment1030 bpFragment800 bpPinus sylvestris + –P. uncinata subsp. uliginosa – +2. Analýzou mikrosatelitové oblasti cpDNA Pt41093Lokus mikrosatelitové oblasti chloroplastové DNA Pt41093 lzepoužít jako druhově specifický marker <strong>pro</strong> odlišení P. sylvestrisa P. mugo (Wachowiak et al., 2006). Protokol použitelný <strong>pro</strong>odlišení druhu P. sylvestris a P. uncinata subsp. uliginosa shrnulyVejsadová a Lukášová (2010). Z izolované celkové DNA pomocíPCR namnožíme úsek cpDNA Pt41093. Použijeme primerypodle Vendramina et al. (1996): primer 1: 5‘-TCC CGA AAATAC TAA AAA AGC A-3‘ a primer 2: 5‘-CTC ATT GTTGAA CTC ATC GAG A-3‘.PCR směs ve finální koncentraci obsahovala 10 ng celkovéDNA, 2.5mM MgCl2, <strong>100</strong>μM dNTP, 0.2μM každého primeru,0.25 U Taq polymerázy a 1× koncentrovaný reakčnípufr. Teplotní <strong>pro</strong>gram PCR se skládá z počáteční denaturace5 min při 95 °C a 5 min při 80 °C, následuje 25 opakovanýchcyklů: 60 s při 94 °C, 60 s při 55 °C, 60 s při 72 °C, zakončeno8 min inkubací při 72 °C. Vzorky pak analyzujeme nanesenímna 8% polyakrylamidový vertikální gel a elektroforetickýmrozdělením v TBE pufru. Po obarvení stříbrem se ukáží mezidruhovérozdíly v délce namnoženého fragmentu. V případěP. sylvestris tento mikrosatelitový úsek cpDNA vykazuje délku78–82 bp (< 82), kdežto u P. uncinata subsp. uliginosa se délkafragmentu pohybuje mezi 86–92 bp (> 86), tab. 3.Tab. 3 Hodnocení druhové příslušnosti (+ fragment přítomen,– fragment nepřítomen)DruhFragment< 82 bpFragment> 86 bpPinus sylvestris + –P. uncinata subsp. uliginosa – +Mikro<strong>pro</strong>pagace borovice blatkyMikro<strong>pro</strong>pagace je často využívanou technikou zvláště <strong>pro</strong>množení dřevin. In vitro regenerace u druhů jehličnatých dřevinje účinným <strong>pro</strong>středkem <strong>pro</strong> namnožení velkého objemugeneticky čistého materiálu. Jak uvádí Malá et al. (1999), lzeorgánové kultury dřevin pěstované in vitro pokládat za genetickystabilní, <strong>pro</strong>tože nedochází k chromozómovým změnám.Klonový materiál lze množit dvěma způsoby: indukcíorganogeneze nebo somatické embryogeneze na primárnímexplantátu. Metoda organogeneze je u jehličnatých stromůpodstatně obtížnější než u listnatých druhů. Úspěšnost způsoburegenerace explantátů u borovic závisí na mnoha faktorech,jako je stáří a fyziologický stav donorového jedince, doba odběru,způsob uchovávání výchozího materiálu, technika povrchovésterilizace, typ použitého explantátu a růstové vlastnostistudovaného druhu (Libby a Ahuja, 1993; Aitken-Christie,1984). U Pinus sylvestris a P. nigra byla iniciována organogenezepřes indukci axilárních pupenů a prýtů (Chalupa, 1986;Salajová, 1992; Sul a Korban, 2004). U dospělých stromů boroviceblatky byla iniciace morfogeneze velmi obtížná, podařilose iniciovat organogenezi u izolovaných zimních pupenů,avšak odvodit sekundární kultury se nepodařilo (Vejsadová,Šedivá, 2002). Pro indukci organogeneze u blatky byly <strong>pro</strong>topoužity jako výchozí explantáty vrcholové části hypokotylus děložním nodem, které byly odřezány z naklíčených zralýchsemen (Vejsadová et al., 2008; Vejsadová, Lukášová, 2010).Mikro<strong>pro</strong>pagační postupy zahrnující indukci organogeneze,tvorbu prýtů i kořenů, podmínky účinné aklimatizace in vitrorostlin i jejich dopěstování v podmínkách ex situ jsou uvedenyv následujících bodech.Odběr semen na lokalitě a uskladnění semenSemena byla v době zralosti odebrána z fenotypově a genetickyověřených výběrových stromů borovice blatky na Borkovickýchblatech. Odebraná semena byla uskladněna v označenýchpapírových sáčcích v uzavřeném boxu se silikagelemv chladové místnosti při teplotě 6–8 °C.Sterilní výsevZ důvodu urychlení klíčení byla zralá semena namočena dovody a ponechána po dobu 3 dnů v lednici při teplotě 4 °C.Poté byla v laminárním boxu sterilizována 7,2% roztokemchlornanu vápenatého [Ca (ClO) 2] po dobu 30 min s krátkýmpředošetřením 70% ethanolem. Jako výsevní médium bylopoužito MS (Murashige a Skoog, 1962) médium s 1 / 10koncentrací solí bez vitaminů zpevněné 7 g l -1 agar (Sigma).149
- Page 1 and 2:
A C T AP R U H O N I C I A N A100 2
- Page 3 and 4:
OBSAHVýzkumný ústav Silva Tarouc
- Page 5 and 6:
Acta Pruhoniciana 100: 5-27, Průho
- Page 7 and 8:
trvalé zeleně ve venkovské kraji
- Page 9 and 10:
ka přirozených lesů ČR, která
- Page 11 and 12:
Odrůda Rod/druh Šlechtitelské os
- Page 13 and 14:
Publikace v periodikách s impaktem
- Page 15 and 16:
V oblasti výměny rostlinného mat
- Page 17 and 18:
(aktidionu) proti padlí jabloňov
- Page 19 and 20:
28/1974Hieke, K.: Dřeviny zámeck
- Page 21 and 22:
55/1988Benetka, V., Kodýtek, K.: V
- Page 23 and 24:
Peš, T.: Kolekce druhů rodu Pinus
- Page 25 and 26:
Drobilová, L.: Evaluating ecologic
- Page 27:
Havlíčková, K., Knápek, J.: Eko
- Page 30 and 31:
vyhovující, a to jak z hlediska l
- Page 32 and 33:
Převodní klíč pro úpravu zákl
- Page 34 and 35:
V tabulce 1 jsou vedle údaje o cen
- Page 36 and 37:
ní jehličnatých stromů na trval
- Page 39 and 40:
Tab. 7 Postup výpočtu základní
- Page 41 and 42:
Acta Pruhoniciana 100: 41-49, Průh
- Page 43 and 44:
Databáze (mapy) BPEJ. Komoditní a
- Page 45 and 46:
Obr. 1 Cenové mapy biomasy z energ
- Page 47 and 48:
Cenové mapy vybraných zdrojů bio
- Page 49:
V případě, že nebude pěstován
- Page 52 and 53:
z výsledků počáteční fáze v
- Page 54 and 55:
Tab. 2 Sortiment vrb a topolů v po
- Page 56 and 57:
Graf 1 Hektarové výnosy sušiny t
- Page 58 and 59:
Tab. 6 Růstové parametry topolů
- Page 60 and 61:
Obr. 5 Klon topolu P_070 při prvn
- Page 62 and 63:
Trnka, M., Trnka, M. jr., Fialová,
- Page 64 and 65:
Obr. 1 Poloha zkoumaného území v
- Page 66 and 67:
(např. požární nebo koupališt
- Page 68 and 69:
68Obr. 3 Typy procesů změn využ
- Page 70 and 71:
70Obr. 4 Typy procesů změn využ
- Page 72 and 73:
Haase, D., Walz, U., Neubert, M., R
- Page 74 and 75:
ministrativně i přírodně vymeze
- Page 76 and 77:
výškou 271 m n. m. a středním s
- Page 78 and 79:
úvalu a Ždánickém lese, zatímc
- Page 80 and 81:
Obr. 4 Využití krajiny v geomorfo
- Page 82 and 83:
Obr. 10 Trajektorie změn využití
- Page 84 and 85:
vém úseku) věnovali Havlíček e
- Page 86 and 87:
Skanes, H. M., Bunce, R. G. H. (199
- Page 88 and 89:
ústavu Jána Lipského v Banské B
- Page 90 and 91:
zobrazení (do roku 1934) a v letec
- Page 92 and 93:
Obr. 6 Využití toposekcí 1 : 25
- Page 94 and 95:
Obr. 9 Ukázka dvoubarevné německ
- Page 96 and 97:
Tab. 1 Označení a rozměry vydáv
- Page 99 and 100: Acta Pruhoniciana 100: 99-107, Prů
- Page 101 and 102: Inventarium (1807, březen) - ručn
- Page 103 and 104: Tabulka 1 Přehled domácích dřev
- Page 105 and 106: Salix purpurea L. cv Salix purea ad
- Page 107 and 108: 44) Křesadlová (2004, s. 41, 60)
- Page 109 and 110: Acta Pruhoniciana 100: 109-114, Pr
- Page 111 and 112: Tab. 2 Porovnávané listové a kv
- Page 113 and 114: ‘Perkeo’ ‘Ra’ a ‘Endeavou
- Page 115 and 116: Acta Pruhoniciana 100: 115-122, Pr
- Page 117 and 118: ostlin, tak v rámci skupiny shodn
- Page 119 and 120: Obr. 1 Miscanthus sinensis (A. Baro
- Page 121 and 122: k poškození i zralých (loňskýc
- Page 123 and 124: Acta Pruhoniciana 100: 123-130, Pr
- Page 125 and 126: Tab. 1 Přehled a vyhodnocení chov
- Page 127 and 128: Obr. 2 Seiridium cardinale na Cupre
- Page 129 and 130: Obr. 10 Rhododendron necrotic rings
- Page 131 and 132: Acta Pruhoniciana 100: 131-135, Pr
- Page 133 and 134: Obr. 1 Silně náchylná a odolná
- Page 135 and 136: při výběru nejodolnějších ros
- Page 137 and 138: Acta Pruhoniciana 100: 137-145, Pr
- Page 139 and 140: typech společenstev a výsadeb, kd
- Page 141 and 142: Plocha č. Lokalizace Souřadnice N
- Page 143 and 144: ná úroveň poškození porostů j
- Page 145 and 146: EPPO (2007): Ash dieback in Europe
- Page 147: Acta Pruhoniciana 100: 147-153, Pr
- Page 151 and 152: Dopěstování rostlin v podmínká
- Page 153 and 154: Wachowiak, W., Stephan, B. R., Schu
- Page 155 and 156: Acta Pruhoniciana 100: 155-160, Pr
- Page 157 and 158: Obr. 1 P. vernalis rostlina se zral
- Page 159 and 160: Tab. 4 Repatriace a výsadby na gen
- Page 161 and 162: Acta Pruhoniciana 100: 161-166, Pr
- Page 163 and 164: Ke statistickému zpracování gene
- Page 165 and 166: Tab. 5 Populačněgenetické parame
- Page 167 and 168: 167