Acta 100 - Výzkumný ústav Silva Taroucy pro krajinu a okrasné ...

žití semenáčů. Přitom naopak podle studie Angeloni et al.(2010) stupeň inbrední deprese významně vzrůstá s velikostípopulace. To se dá vysvětlit tím, že relativně malá populaces dlouhou inbrední historií a vyšším stupněm inbreedingumůže trpět inbrední depresí méně než větší populace díky jižuskutečněnému vyčištění genetické zátěže v předchozích generacích.Také Thiele et al. (2010) zjistili vyšší inbrední depresiv početně větší populaci Silene nutans L. v porovnánís menší populací. Při studiu potomstva izolované populaceP. nigra s omezeným počtem jedinců zjistili Benetka et al.(2008) výskyt spontánního inbreedingu a pozorovali jeho negativnídopad na získanou generaci.Cílem naší práce bylo: 1) zjistit, v jaké míře dochází ke spontánnímuinbreedingu v porostu topolu černého s vyšší nabídkouotců, a 2) určit, zda došlo v získaném potomstvu k inbrednídepresi pomocí provedení zkoušky klíčivosti, sledovánízdravotního stavu a měření růstových charakteristik jednotlivýchpotomků.MATERIÁL A METODIKAK pokusu byl vybrán porost P. nigra nacházející se na lokalitěMichovka v areálu VÚKOZ, v. v. i., v Průhonicích. Tentoporost je složen ze sedmi sourozeneckých skupin (každáskupina je potomstvem jiných rodičů). Ze skupiny jedincůpocházejících z křížení výběrových stromů 880060 × 880016byly vybrány pro křížení jeden samičí (S) a dva samčí stromy(B xa B y).OpylováníNa jaře 2010 byly květní větve samičího a obou samčíchstromů odebrány těsně před rozkvětem a umístěny do lahvís vodou, a to větve se samičími květy do skleníku a větve sesamčími květy do oddělených místností s pokojovou teplotou.Kontrolované opylení (KO) bylo provedeno podle Benetky etal. (2008). Samičí květní větve byly rozděleny na 2 části, přičemžbyla každá část opylena pylem z jiného samčího stromu,v tomto případě bratra. Pro kontrolu ke KO bylo ze stejnéhosamičího stromu odebráno náhodně z různých míst několikvolně sprášených (VS) větví s tobolkami.Zkouška klíčivostiZískaná semena ze všech tří variant opylení (S × B x, S × B y,S VS ) byla vyseta do truhlíků. Pro zkoušky bylo použito maximálně100 ks semen z každé varianty. Energie klíčení bylazjišťována po 3 dnech od vysetí jako procentuální podíl vyklíčenýchsemen a klíčivost byla zjišťována po 10 dnech od vysetíjako procentuální podíl vyklíčených semen s listy, podleČSN 48 1211.Polní pokusV prvním roce (2010) byly získané semenáče z každé varianty(23, 25, resp. 57 jedinců) opylení vysázeny do sadbovačů QP35 T a na jaře 2011 přesazeny na venkovní experimentálníplochu v uspořádání znáhodněných bloků ve 4 opakováních.Několikrát během vegetace byl hodnocen stupeň napadenírzí Melampsora larici-populina Kleb., významného patogenatopolů, pomocí šestibodové stupnice (od 0 do 5, tj. bez infekceaž po plnou nekrózu a opad listů) (Benetka et al., 2007).Na konci vegetačního období byly měřeny růstové znaky,přičemž výška rostlin byla změřena v obou letech (v prvnímroce s přesností 1 mm, ve druhém roce s přesností 10 mm)a tloušťka rostlin ve výšce 0,05 m a 0,5 m pouze ve druhémroce trvání pokusu (s přesností na 0,1 mm).Extrakce DNA z rostlinného materiáluZ celkem 95 rostlin (40 semenáčů z KO, 40 semenáčů z VS,1 samičí mateřský strom a 14 samčích, potenciálně otcovských,stromů) byly odebrány čerstvé listy k následným analýzám.Listy byly zchlazeny, poté zmraženy v tekutém dusíku, lyofilizoványa ze suchého materiálu byla extrahována celková DNApomocí komerční sady DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) podlenávodu výrobce. Měření koncentrace, kvality a čistoty izolátubylo provedeno na přístroji NanoDrop (Thermo Scientific).Genetické analýzyBylo použito celkem 8 mikrosatelitových DNA lokusů (SSR– simple sequence repeat), vyvinutých pro druh P. nigra L.:WPMS 04, WPMS 07, WPMS 09, WPMS 12 (van der Shootet al., 2000), WPMS 14, WPMS 16, WPMS 20 (Smulders etal., 2001) a PMGC14 dostupný z databáze Poplar MolecularGenetics Cooperative (http://poplar2.cfr.washingthon.edu/pmgc). Všechny lokusy byly jednotlivě amplifikovány pomocítechniky PCR. Pro markery WPMS 04, WPMS 07, WPMS09, WPMS 12 a PMGC14 byl použit protokol podle van derShoota et al. (2000), pro markery WPMS 14, WPMS 16,WPMS 20 protokol podle Smulderse et al. (2001). Reverzníprimery byly značeny fluorescenčními barvivy (FAM, VIC,NED, PET). Po amplifikaci byly smíchány čtyři produktyPCR (čtyři SSR lokusy s různými fluorescenčními barvivy)s deionizovaným formamidem a velikostním standardem GeneScan500 bp (Applied Biosystems) značeného fluorescenčníbarvou LIZ a byla provedena fragmentační analýza v automatickémanalyzátoru ABI 310 (Applied Biosystems).Vyhodnocení výsledkůZískaná data o zdravotním stavu a růstových vlastnostech semenáčůbyla analyzována s použitím programu Statistica 8.0software package (StatSoft Inc., Tulsa, OK). Pomocí chi-kvadrátubyly testovány nulové hypotézy u znaků: hodnota energieklíčení a hodnota klíčivosti potomků pocházejících ze 3 typůopylení. Rozdíly ve všech pozorovaných charakteristikáchvšech 3 variant opylení byly testovány pomocí MANOVA(ve všech případech byly splněny předpoklady MANOVA).Jako závislé proměnné byly použity pozorované charakteristikya jako nezávislá proměnná byla použita varianta opylení.Testy byly prováděny na hladině významnosti α < 0,05.Inbrední deprese δ byla vypočtena podle vztahu δ = 1 - (W i. W o-1),kde W ije průměrná hodnota znaku sady inbredních jedincůa W oje průměrná hodnota znaku sady jedinců z nepříbuzenskéhoopylení (Lande, Schemske, 1985).162