Untersuchungen zu familiären und rassespezifischen ...

Familiärer hypophysärer Hyperadrenokrtizismus beim Rauhaardackel 47
GLDH und AP, Blutkonzentrationen von Harnstoff und Kreatinin sowie die Werte der
Blutgase, des Säure-Base-Haushaltes und der Blutelektrolyte bestimmt. Hund B
konnte vor der Euthanasie adspektorisch und palpatorisch allgemein untersucht
werden. Die Untersuchung im Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche
Hochschule Hannover umfasste die Erhebung morphologischer und histologischer
Veränderungen von Hund A und B. Auch der Vater dieser Hunde wurde
adspektorisch und palpatorisch untersucht. Die Mutter wurde pathomorphologisch
untersucht.
Im Rahmen der Sektion konnten von Hund B in RNAlater konservierte Proben zur
Isolierung der mRNA aus verschiedenen Organen, darunter der Leber, entnommen
werden, um die Expressionshöhe des caninen MDR1-Gens (multidrug resistance
oder ABCB1, ATP-binding Cassette, subfamily B member 1; GenBank
NM_001003215) im Lebergewebe zu bestimmen.
Aus der Leber von Hund B wurde die mRNA mittels des RNeasy 96 Universal Tissue
Kits (Qiagen, Hilden) gemäß den Herstellerangaben isoliert. Die Umschreibung in
cDNA erfolgte unter Benutzung der SuperScript III Reverse Transkriptase
(Invitrogen, Karlsruhe), eines Oligo-dT Primers und 10 µl der isolierten RNA in einem
20 µl Reaktionsansatz. Zur Quantifizierung des MDR1 Gentranskriptes wurde eine
PCR (polymerase chain reaction) mit dem in Exon 12 liegenden Vorwärtsprimer 5’-
GAC CGT GCA GCT GAT GCA-3’ und dem in Exon 13 liegendem Rückwärtsprimer
5’-GGT CCT AAT GTC CTG TCC ATC AA-3’ zur Amplifikation eines 79 bp großen
PCR-Produktes mit einer an der Grenze von Exon 12 zu Exon 13 liegenden VIC-
markierten TaqMan MBG (minor groove binding)-Sonde durchgeführt. Als endogene
Kontrolle wurde das canine Haushaltsgen GAPDH (Glyceraldehyd-3-Phosphat-
Dehydrogenase) herangezogen. Mit dem Vorwärtsprimer 5’-GGC ACA GTC AAG
GCT GAG AAC-3’ in Exon 4 und dem Rückwärtsprimer 5’-TCC AGG AGC GAG
ATC-3’ in Exon 5 wurde ein 101 bp großes Produkt mit einer im Grenzbereich von
Exon 4 zu Exon 5 liegenden FAM-markierten TaqMan MGB-Sonde gemäß der
caninen mRNA-Referenzsequenz (GenBank NM_001003142) amplifiziert. Die
anschließende quantitative RT-PCR wurde mit dem ABI 7300 Sequence Detection
System (Applied Biosystems) in einem 20 µl Reaktionsansatz mit dem SensiMix DNA