Untersuchungen zu familiären und rassespezifischen ...

Molekulargenetische Analysen
Gelelektrophorese
Augenmissbildungen bei homozygoter Merle-Mutation 80
Zur Darstellung von Exon 11 und des angrenzenden Introns 10 des SILV-Gens der
vier Altdeutschen Hütehunde wurde mit den von Clark et al. (4) verwendeten Primern
(Vorwärtsprimer: 5’-CAGTTTCTCCTTTATTCTCCCA-3’; Rückwärtsprimer: 5’-
CCTCGGCAAATCACAGCA-3’) eine PCR zu denselben Bedingungen (5 min 95°C; 5
Zyklen zu 30 sec at 95°C, 15 sec bei 58°C, 10 sec bei 72°C, 30 Zyklen z u 20 sec bei
95°C, 15 sec bei 56°C, 10 sec bei 72°C, und schließlich 5 min bei 72°C)
durchgeführt. Anschließend wurden die PCR-Produkte zusammen mit einem
Längenstandard auf einem 2%igen ethidiumbromidhaltigen Agarosegel aufgetragen.
Nach der elektrophoretischen Auftrennung der Allele wurde das Gel unter
ultraviolettem Licht ausgewertet. Als Referenztiere für die molekulargenetischen
Untersuchungen wurden ein schwarzer Labrador Retriever (mm), ein blue-merle
Collie (Mm) und ein red-merle Australian Shepherd (Mm) herangezogen.
Bei der Auswertung der Gelbilder konnte deutlich zwischen den beiden Merle-Allelen
(M und m) des SILV-Gens unterschieden werden, da zwischen ihnen ein Abstand
von ca. 250 bp bestand. Der Labrador Retriever besaß nur eine Bande etwa auf
Höhe von 200 bp und konnte somit eindeutig als mm-Genotyp eingestuft werden.
Auch bei den beiden anderen Referenzhunden entsprach das Gelbild dem Phänotyp:
sowohl der blue-merle Collie als auch der red-merle Australian Shepherd besaßen je
eine Bande bei ca. 200 bp und eine Bande bei knapp 500 bp. Damit waren diese
beiden Tiere wie erwartet heterozygot Merle (Mm).
Um mögliche Längenunterschiede der SINE-Insertionsmutation zwischen Hunden mit
und ohne Augenmissbildungen aufzudecken, wurde die Gelelektrophorese auch auf
einem 4%igen Agarosegel durchgeführt. Bei dieser Methode können Unterschiede
etwa im Bereich ab 10 bp erkannt werden. Es wurde außerdem ein bereits in der
SINE-Insertionsmutation liegender Primer entwickelt und mit IRD700 markiert. Das
PCR-Produkt wurde auf einem 4%igem Polyacrylamidgel auf dem automatischen
Sequenziergerät LI-COR 4200/S-2 (Lincoln, NE, USA) aufgetragen. Hierbei können
bereits Unterschiede einzelner Basenpaare gesehen werden.