Identifikation und Charakterisierung - OPUS - Universität Würzburg

I. Einleitung
Vα1
?
Vß6
Vα2 Vß7
Vα3 Vß8
Vα4 Vß9
Vα5 Vß10
Man erhält zwar die Sequenzen aller im Gewebe vorhandenen TZR-Ketten, kann jedoch keine
eindeutige Zuordnung treffen.
Alle bisher durchgeführten Versuche, aus Gewebe anhand von Mikrodissektion Einzelzellen
zu isolieren und diese mit Einzelzell-PCR zu analysieren, konnten lediglich die TZR-β-Kette
nicht aber die gepaarte α-Kette amplifizieren. Als Template für die PCR-Reaktion verwendete
man hier genomische DNA und keine RNA. Der Vorteil genomischer DNA ist die weitaus
größere Stabilität während des Färbe- und Isolationsprozesses. Nachteilig hierbei ist jedoch,
dass nur eine Kopie als Template vorliegt (Babbe et al., 2000; Hofbauer et al., 2003; Skulina et
al., 2004).
Beide TZR-Ketten aus derselben Zelle zu amplifizieren, gelang bisher nur mit lebenden Zellen.
Diese wurden nach Homogenisieren des Gewebes mittels FACS-Sort vereinzelt und nach
Proliferation in die Analyse eingesetzt (Baker et al., 2002; Hamroumi et al., 2003; Tahara et
al., 2003).
Im Rahmen dieser Arbeit gelang es zum ersten Mal beide TZR-Ketten derselben, aus Gewebe
isolierten Einzelzelle, zu amplifizieren. Als Template diente RNA. Die RNA ist im Gegensatz
zur DNA zwar wesentlich instabiler, kommt jedoch in höherer Kopienzahl vor und besteht nur
aus der codierenden Sequenz.
Der folgende Abschnitt zeigt am Beispiel einer Muskelbiopsie die einzelnen Schritte, die nötig
sind, um aus einer Gewebeprobe potentiell autoaggressive T-Lymphozyten zu isolieren und zu
analysieren.
7.2 Vorgehensweise zur Detektion und Analyse potentiell
autoaggressiver T-Lymphozyten aus Gewebe
Potentiell autoaggressive T-Lymphozyten aus einer Muskelbiopsie müssen zwei Kriterien
erfüllen. Zum einen müssen sie im Gewebe klonal expandiert sein, da dies auf eine Antigenvermittelte
Immunantwort schließen lässt. Zum anderen müssen sie im engen Kontakt zur
Muskelfaser stehen. Dieser enge Kontakt zeigt ebenfalls die potentielle Autoaggresivität der T-
Zelle. Nicht kontaktierende sog. bystander-Zellen, die wahrscheinlich durch
Cytokinausschüttung angelockt wurden, kann man so klar abgegrenzen.
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