Identifikation und Charakterisierung - OPUS - Universität Würzburg

III. Ergebnisse
5.2.3 CD8-Transduktion der Transfektanten durch Retroviren
Anschließend wurde mittels retroviraler Transduktion die genetische Information für den
menschlichen CD8-Corezeptor in die Maus-Hybridome gebracht. Hierfür verwendeten wir die
Verpackungszelllinie GP+E 86, welche zuvor mit einem retroviralen Vektor, der das Gen für
den menschlichen CD8-Corezeptor trägt, transfiziert wurde. Die Virionen, die nun von der
Verpackungszelllinie produziert werden, infizieren die Zielzellen und das übertragene Gen
wird exprimiert.
Die Transduktion
wurde wie unter II.4.6 beschrieben durchgeführt und der Erfolg der
Transduktion mittels FACS-Analyse überprüft. Hierfür verwendeten wir einen AK, der gegen
die β-Kette des CD8-Moleküls gerichtet ist. Die erfolgreiche Virustransduktion ist in Abb. 36
dargestellt.
Abb. 36: FACS-Analyse der transfizierten Hybridomzellen zum Nachweis der CD8-Expression auf der Zelloberfläche
In einer FACS-Analyse wurde die Oberflächenexpression des CD8-Moleküls der TZR-Transfektanten nach
der retroviralen Transduktion
überprüft. Alle vier Transfektanten zeigten ein positives Ergebnis.
Mit
diesen TZR- und CD8-positiven Transfektanten war nun eine Antigensuche möglich.
6. TZR JM22 als Modell-System für die Antigensuche
Als Modell für die Antigensuche klonierten wir einen weiteren TZR, der aus der Literatur
als
JM22 bekannt ist (Moss et al., 1991). Dieser TZR besteht aus einer Vα10-Jα42- sowie einer
Vβ17-Jβ2.7-Kette. Er erkennt das Peptid 58-66 (GILGFVFTL) des Influenza A Matrix
Proteins, genannt flu, wenn dieses auf HLA-A*02 präsentiert wird. Das flu-Antigen wurde
sowohl als synthetisches Peptid eingesetzt als auch in ein Expressionsplasmid kloniert und in
die APZ transfiziert. Der Einsatz des synthetischen Peptids simuliert die Zugabe der Library-
Peptidmixe zu den Zellen. Es erfolgt hier eine Beladung der MHC-Klasse I-Moleküle von
außen. Bei der Transfektion des flu-Konstruktes in die HLA-A*02 positiven APZ wird das
Peptid in der Zelle auf MHC-I-Moleküle gebunden und über den MHC-Klasse I-
Präsentationsweg auf der Zelloberfläche präsentiert.
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