Identifikation und Charakterisierung - OPUS - Universität Würzburg

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II. Material und Methoden 4.6 Transduktion von Zellen mit Hilfe von Retroviren Unter einer Transduktion versteht man die Übertragung von Genen mit Hilfe von Viren. Hier wurde das Gen für den menschlichen CD8-Corezeptor mittels Retroviren in die Maus- Hybridomzellen eingebracht. Als Zelllinie für die Retrovirus-Produktion wurde die Verpackungszelllinie GP+E 86 (Klon 1A1) verwendet, welche zuvor mit einem retroviralen Vektor, der das Gen für den menschlichen CD8-Corezeptor trug, transfiziert wurde. Die Virionen, die nun von der Verpackungszelllinie produziert wurden, konnten die Zielzellen infizieren und das übertragene Gen wurde exprimiert. Am Vortag wurden die GP+Es 86 in eine 6-well-Platte ausgebracht, so dass sie am nächsten Tag eine Konfluenz von etwa 40% aufwiesen. Anschließend wurden 5x10 4 Zellen der zu transduzierenden Maus-Hybridomzellen pro ml Medium zugegeben und für 48 Stunden cokultiviert. Während dieser Zeit wurde kein Selektionsantibiotikum ins Medium gegeben. Nach zwei Tagen wurden die Hybridomzellen vorsichtig abgenommen und nun unter Selektionsdruck weiter kultiviert. Der Erfolg der Transduktion konnte nach 4-5 Tagen mittels FACS-Analyse überprüft werden. 4.7 FACS-Analyse Zum Nachweis von Oberflächenproteinen wurden die Zellen durchflußzytometrisch mit einem FACS-Gerät (FACSSort, FACSCalibur von Becton Dickinson) analysiert. Für jede Färbung wurden mind. 50.000-200.000 Zellen benötigt. Die Zellen wurden in die entsprechenden Näpfe einer 96-well-Spitzbodenplatte überführt und zweimal mit 200µl FACS- Puffer (1% FCS in PBS) gewaschen. Es wurden sowohl Färbungen mit direkt markierten AK, als auch Färbungen bei denen der sekundäre AK markiert war, durchgeführt. Die Zellen wurden in 50µl verdünnter AK-Lösung 30min auf Eis im Dunkeln inkubiert (Verdünnung 1:50 in FACS-Puffer) und anschließend erneut zweimal mit 200µl FACS-Puffer gewaschen. Wurde ein sekundärer AK zur Färbung eingesetzt, wurde das Verfahren mit einer Verdünnung von 1:200 wiederholt. Nach der letzten AK-Färbung wurden die Zellen zur Messung in FACS- Röhrchen überführt. Um die Detektion toter Zellen zu ermöglichen, wurde Propidiumjodid in einer Konzentration von 2µg/ml zu den gefärbten Zellen gegeben. Tote Zellen nehmen aufgrund ihrer defekten Zellmembran Propidiumjodid auf und zeigen daher bei einer Wellenlänge von 600-650nm ein starkes Signal. So konnte diese tote Zellpopulation bei der Analyse der Zellen ausgeschlossen werden. Mit dem FACS-Gerät wurden die Parameter Licht-Streuung, Extinktion und Fluoreszenz der einzelnen Zellen bei den jeweils erforderlichen Wellenlängen gemessen. Der 50
II. Material und Methoden Fluoreszenzhintergrund wurde mit einer Negativ-Kontrolle so eingestellt, dass die Emission im unteren Rand des Messbereichs lag. Pro Probe wurden 10.000 Zellen analysiert und anschließend mit einem Statistikprogramm des FACS-Gerätes ausgewertet. 4.8 Aktivierung der Transfektanten 4.8.1 Physiologische Aktivierung der Transfektanten Die Kreuzvernetzung der TZR-Moleküle durch spezifische monoklonale AK führt zu einer physiologischen Aktivierung der Maus-Hybridomzellen worauf diese Interleukin-2 (IL-2) sezernieren. Diese IL-2-Produktion wurde gemessen, um die Funktionalität der transfizierten Hybridomzellen zu untersuchen. In die Näpfe einer 96-well-Flachbodenplatte wurden 100µl des AK (verdünnt in PBS) mit einer Konzentration von 1µg/ml pipettiert und für mindestens zwei Stunden im Brutschrank inkubiert. Die AK-Lösung wurde abgesaugt und durch RPMI1640 ersetzt. Anschließend wurden 4x10 4 Zellen der zu testenden Transfektanten zugegeben und im Brutschrank inkubiert. Die IL-2-Konzentrationen in den Überständen wurden nach 16h durch EILISA gemessen. 4.8.2 Spezifische Komplexe Aktivierung der Transfektanten über MHC/Peptid- Die Aktivierung von T-Lymphozyten im Körper geschieht über die Bindung des spezifischen Peptids, welches durch das MHC-Molekül auf der Zelloberfläche einer APZ präsentiert wird und bewirkt eine Sekretion von IL-2. Der gleiche Vorgang kann bei den Maus-Hybridomzellen JM22 beobachtet werden, wenn man diese mit dem auf HLA-A*02 präsentierten flu-Peptid 58- 66 aktiviert. Hierzu wurden am Vortag 3x10 4 Maus-LTK-Zellen, die mit dem entsprechenden humanen HLA-Molekül HLA-A*02 transfiziert waren, in eine 96-Loch-Mikrotiterplatte ausgesät und über Nacht bei 37°C inkubiert. Diese Antigen-präsentierenden Zellen (APZ) wurden am folgenden Tag für 4-6 Stunden mit dem flu-Peptid (5µM) inkubiert, anschließend 4x10 5 Zellen des zu testenden Maus-Hybridom-Transfektanten JM22 zugegeben und für 13-16 Stunden inkubiert. Am nächsten Tag wurde die IL-2-Konzentration der Überstände im IL-2-ELISA gemessen. 51
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Eingereicht am: 13.02.2007 Mitglied
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Inhaltsverzeichnis 1.6.1.2 Primer f
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Inhaltsverzeichnis 4.8.2 Spezifisch
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Seite 59: II. Material und Methoden Nach der
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Seite 69 und 70: III. Ergebnisse 2.1 Färbung und Is
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Seite 73 und 74: III. Ergebnisse positives Signal ze
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Seite 77 und 78: III. Ergebnisse (II.3.2) auf Folien
Seite 79 und 80: III. Ergebnisse Abb. 22a: Analyse d
Seite 81 und 82: III. Ergebnisse Abb. 24: PCR-Produk
Seite 83 und 84: III. Ergebnisse rev-spec; Vα-11-fo
Seite 85 und 86: III. Ergebnisse Abb. 30: PCR-Produk
Seite 87 und 88: III. Ergebnisse Sal I Bgl II Bam HI
Seite 89 und 90: III. Ergebnisse Abb. 33: Überprüf
Seite 91 und 92: III. Ergebnisse 5.2.3 CD8-Transdukt
Seite 93 und 94: III. Ergebnisse Abb. 37a: FACS-Anal
Seite 95 und 96: III. Ergebnisse 7.1.1 Expression de
Seite 97 und 98: III. Ergebnisse transfiziert und ü
Seite 99 und 100: III. Ergebnisse 8. Versuch der Iden
Seite 101 und 102: III. Ergebnisse Abb. 44: Position 3
Seite 103 und 104: IV. Diskussion IV. Diskussion Der H
Seite 105 und 106: IV. Diskussion Vβ1 sowie Vβ23, is
Seite 107 und 108: IV. Diskussion aus diagnostischen G
Seite 109 und 110: IV. Diskussion durch das entspreche
Seite 111 und 112:
IV. Diskussion Hemmer et al. (1999)
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V. Literaturverzeichnis V. Literatu
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V. Literaturverzeichnis Engel, A.G.
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V. Literaturverzeichnis Kinne, R.W.
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V. Literaturverzeichnis Steinman, L
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VI. Anhang VI. Anhang 1. Sequenzen
Seite 123 und 124:
Erklärung gemäß §4 Abs. 3 S. 3,
Seite 125 und 126:
Vorname: Sabine Nachname: Seitz Leb
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