Identifikation und Charakterisierung - OPUS - Universität Würzburg

III. Ergebnisse
Lymphozyt oftmals ein wenig entfernt von der Muskelfaser erscheint. Die zuvor gezeigten
Testfärbungen wurden unter optimalen Bedingungen, auf Glasobjekträgern ohne Folie und mit
einem Deckglas überlagert durchgeführt. Hierdurch erhält man eine wesentlich bessere
Qualität. Der aus dem Gewebe ausgeschnittene Bereich erscheint im Verhältnis zur Größe der
isolierten Zelle relativ groß. Dies liegt an der Dicke des Laserstrahls, der die Zelle aus dem
Gewebeverband löst. Der Bereich, der nach dem Ausschneiden vom Gewebe übrig bleibt und
in das PCR-Reaktionsgefäß katapultiert wird, ist nicht viel größer als die T-Zelle selbst. Ein
gewisser Sicherheitsabstand muss natürlich eingehalten werden, damit die Zelle bei der
Isolation nicht beschädigt wird und dadurch RNA verloren geht.
Die Analyse der isolierten Zellen durch die Einzelzell-RT-PCR ist in Kapitel III.3.2
beschrieben.
Aus dem Patient IBM15551 isolierten und analysierten wir insgesamt 250 Vβ23 + Einzelzellen.
Die Patientenbiopsie war sehr klein, weshalb wir keine weiteren Zellen analysieren konnten.
Die Färbung erfolgte ebenfalls mit Alkalischer Phosphatase.
2.2 Färbung und Isolierung expandierter Vβ1 + Einzelzellen aus Blut
und Hirngewebe des MS-Patienten FE
Wie in Punkt III.1.3 bereits aufgeführt, konnten wir bei dem MS-Patienten FE die 2001 im
Blut detektierte Vβ1-Jβ2.3 Expansion in einer frischen Blutprobe von 2003 wieder finden. Wir
analysierten daher zunächst die CD8 + /Vβ1 + T-Lymphozyten dieser Probe, um die Hirnbiopsie
zurückzuhalten. Um die CD8 + /Vβ1 + T-Lymphozyten zu isolieren, wurden die Zellen zunächst
auf CD8 sowie Vβ1 sortiert. Anschließend wurden sie durch Picken mit der Pipette, FACS-
Sort oder Cytospin mit anschließender Lasermikrodissektion in PCR-Reaktionsgefäße
überführt. Insgesamt isolierten wir auf diese Weise 2500 CD8 + /Vβ1 + T-Zellen.
Nach der Analyse der Blutzellen untersuchten wir die Hirnbiopsie des MS-Patienten FE. Die
Färbung erfolgte auf Folienobjekträgern und die Isolation konnte mit dem neuen
Lasermikrodissektionsgerät unter Fluoreszenzbedingungen durchgeführt werden. Die
Fluoreszenzfärbung bringt im Gegensatz zur Färbung mit alkalischer Phosphatase enorme
Vorteile. Dies ist in Abschnitt III.3.1.1 näher erläutert. Da sowohl bei dem MS-Patienten als
auch bei dem Patienten PM16488 eine Vβ1-Expansion vorlag, konnten die gleichen AK
eingesetzt werden. Aus der Hirnbiopsie wurden insgesamt 198 Vβ1 + T-Lymphozyten isoliert.
Nachfolgende Abb. 18 zeigt CD8 + /Vβ1 + T-Lymphozyten, die durch Lasermikrodissektion
isoliert und anschließend analysiert wurden. Das linke Bild zeigt die CD8- das mittlere Bild die
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