Identifikation und Charakterisierung - OPUS - Universität Würzburg

III. Ergebnisse
Vβ1-Färbung der T-Zelle. Das rechte Bild zeigt das Loch nach Isolation der Zelle aus dem
Gewebeverband.
Abb. 18: Fluoreszenzfärbung von Vβ1 + - bzw. CD8 + -T-Lymphozyten aus Hirngewebe des
Patienten FE mit anschließender Lasermikrodissektion
A und B: Fluoreszenzfärbung Vβ1 + -T-Lymphozyten aus Hirngewebe des MS Patienten FE. Die eingesetzte
AK-Konzentration des anti Vβ1-AK betrug 1:200 in 2%Ziegenserum/2% BSA in PBS, die des Ziege-anti-
Ratte-Cy3-AK 1:100 in 2%Ziegenserum/2% BSA in PBS.
A’ und B’: Fluoreszenzfärbung CD8 + -T-Lymphozyten aus Hirngewebe des MS Patienten FE. Die eingesetzte
AK-Konzentration des anti CD8-FITC-AK betrug 1:20 in 2%Ziegenserum/2% BSA in PBS.
A’’ und B’’: Loch im Gewebeverband nach Katapultieren der Einzelzelle in das PCR-Gefäß
Das Gewebe ist auf einen Folienobjektträger aufgebracht und mit PBS überschichtet.
3. Analyse isolierter Einzelzellen durch die Einzelzell-RT-PCR
Nach der Isolation der T-Lymphozyten aus den Geweben sowie aus Blut wurden diese durch
eine speziell entwickelte Einzelzell-RT-PCR-Methode analysiert (II.2.7.3). Im nachfolgenden
Kapitel sind zunächst einige Vorversuche aufgeführt, welche die Effizienz der Methode
aufzeigen sowie die anschließende Analyse der isolierten Einzelzellen der verschiedenen
Patienten.
Der Vorteil der im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Einzelzell-RT-PCR-Methode besteht
darin, dass die TZR-α- und β-Kette derselben Einzelzelle amplifiziert werden können. Dies
war bisher noch nicht möglich. Für die Amplifikation wurde die RNA zunächst mittels RT-
Primer in der konstanten Region der α- und β-Kette in cDNA umgeschrieben (RT-PCR) und
anschließend beide Ketten durch eine Prä-Amplifikation vermehrt (α+β-Prä-Amplifikation).
Da wir für die Amplifikation der TZR-β-Kette klonspezifische Primer einsetzen konnten,
bekannt aus den CDR3-Spektratype-Daten, untersuchten wir die Zellen zuerst auf die
Expression der expandierten TZR-β-Kette (β-PCR). Positive Zellen wurden anschließend auf
eine korrespondierende TZR-α-Kette hin analysiert (α-PCR). Durch die universellen Primer
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