Identifikation und Charakterisierung - OPUS - Universität Würzburg

II. Material und Methoden
PCR-Programm:
1. 96°C 30 sec
2. 55°C 15 sec
3. 60°C 4 min
Die Schritte 1-3 wurden 25mal wiederholt.
Die Proben wurden nun nach erneuter Aufreinigung mit dem Dye-Ex Spin-Kit (Quiagen) für
das Gel vorbereitet und mithilfe des ABI 377 Sequenzers der Firma Applied Biosystems und
einem hochauflösenden Polyacrylamidgel aufgetrennt. Anschließend wurden die Proben mit
dem Programm Sequencing Analysis 3.4.1 der Firma Applied Biosystems analysiert.
2.10 CDR3-Spectratyping
Das CDR3-Spectratyping wurde verwendet, um die TZR-β-Ketten der Gesamt-T-Zell-
Population im Zielgewebe eines Patienten zu untersuchen und mögliche expandierte TZR-β-
Ketten zu detektieren. Hierzu wurden entweder eine ausreichende Menge Muskel- bzw.
Hirngewebe von einem Biopsieblock geschnitten (ca. 20-30 Schnitte je 10µm) oder CD8 + T-
Lymphozyten aus Blut des Patienten isoliert. Hieraus wurde die Gesamt-RNA gewonnen und
diese in cDNA umgeschrieben (II.2.5), die dann in den CDR3-Spectratype eingesetzt werden
konnte.
In einer ersten PCR-Runde wurde die cDNA mit 25 verschiedenen Vβ-Primern gegen einen
Cβ-spezifischen Primer amplifiziert.
Reaktionsansatz erste PCR Runde:
cDNA 1,0 µl
10x PCR-Puffer (mit 15mM MgCl2) 5,0 µl
dNTP (20mM) 0,5 µl
Cβ Primer (1:10) 2,5 µl
Vβ Primer (Vβi=25), jeweils 2,5 µl
AmpliTaq Gold (5U/µl) 0,2 µl
H2O 38,3 µl
50,0 µl
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