Identifikation und Charakterisierung - OPUS - Universität Würzburg

II. Material und Methoden
2.3.3 DNA-Konzentrationsbestimmung
Die Konzentration wässriger DNA-Lösungen wurde photometrisch durch die Bestimmung der
optischen Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 260nm gemessen, bei der das
Absorptionsmaximum von einzel- und doppelstängiger DNA liegt. Die Konzentration der
unterschiedlichen Nukleinsäurearten berechnet sich aus den Absorptionen bei 260nm unter
Einbeziehung des Verdünnungsfaktors.
Die Messung wurde mit dem Spektrophotometer GeneQuant II von Amersham-Pharmacia
durchgeführt.
2.4 Präzipitation von Plasmid-DNA und PCR-Produkten
2.4.1 Präzipitation durch Pellet Paint
Zum Präzipitieren von Plasmid-DNA sowie von PCR-Produkten mittels Pellet Paint Co-
Precipitant von Novagen wurden 2µl Pellet Paint in ein 1,5ml Eppendorf-Reaktionsgefäß
vorgelegt und die gewünschte Menge PCR-Produkt zugegeben. Anschließend wurden 1/10
Volumen 3M Natriumacetat (pH5.2) sowie 2 Volumen 100% Ethanol hinzugefügt und durch
kurzes Vortexen gemischt. Nach 2minütiger Inkubation bei RT wurde das Gemisch 5min bei
14.000rpm zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das DNA-Sediment war durch das rot
gefärbte Pellet Paint deutlich zu erkennen. Das Sediment wurde nun einmal mit 200µl 80%
Ethanol und anschließend mit 200µl 100% Ethanol gewaschen und beide Male 5min bei
13.000rpm zentrifugiert. Nach 10-15minütigem Trocknen wurde die DNA in einem geeigneten
Volumen EB-Puffer resuspendiert.
2.4.2 Präzipitation durch Natriumacetat / Ethanol
Zum Präzipitieren von Plasmid-DNA durch Natriumacetat / Ethanol wurden 1/10 Volumen 3M
Natriumacetat (pH5.2) sowie 2,5 Volumen 100% Ethanol zur gewünschten DNA gegeben und
durch vorsichtiges Vortexen gemischt. Die Proben wurden anschließend für mindestens 30min
bei -80°C inkubiert, um eine vollständige Präzipitation zu gewährleisten. Die Proben konnten
jedoch auch bis zum Gebrauch länger bei -80°C gelagert werden.
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